基因ⅶ型新城疫病毒单克隆抗体的研制、鉴定与初步应用-预防兽医学专业论文.docxVIP

胡顺林：基因ⅥI型新城疫病毒单克隆抗体的研制、鉴定与初步应用基因V 胡顺林：基因ⅥI型新城疫病毒单克隆抗体的研制、鉴定与初步应用 基因V Il型新城疫病毒单克隆抗体的 研制、鉴定与初步应用 研究生：胡顺林 导师：吴艳涛副教授 刘秀梵教授 摘要 1997年以来我国华南和华东部分地区发生了由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)导致的鹅的临诊疾病，而且发现鹅源NDV在体外具有比鸡源和鸽源 毒株更强的致细胞融合的能力，这表明NDV的抗原可能发生了变异。为了对该病 毒的抗原变异进行初步的研究探索进而建立新的NDV检测方法，我们研制了针对 基因VII型NDV的单克隆抗体(简称单抗)。 以基因VII型NDV鹅源毒株ZJl作为免疫原，三次免疫8周龄BALB／c小鼠 后，取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2／0．Ag一14进行融合，通过间接酶联免疫吸附试 验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和血凝抑制试验(hemagglutinin inhibition，HI)对杂交瘤进行双重筛选，经亚克隆后，共获得6株针对NDV的特 异性单抗，分别命名为：IH6、2G5、3A4、385、6BI和8C5。其中2G5、3A4、 385、681和8C5单抗具有血凝抑制特性，腹水的HI效价分别为：214、2”、29、 2”和25，分别属于IgGl、IgGl、IgG2b、IgGl和IgGt亚类，间接ELISA效价均大 于lxl05，间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescent assay，IIFA)效价均大 于lxl04。无m特性的单抗IH6为IgGl亚类，其腹水的ELISA效价也大于lxl05， IIFA效价为lxl03。上述六株单抗所针对的抗原表位均位于血凝素．神经氨酸酶 (hemagglutinin-neuraminidase，HN)蛋白上，除1H6没有中和特性外，其余5株 单抗均具有中和NDV的能力。 用过碘酸钠氧化法，将上述6株单抗及本室保存的另外两株NDV单抗M22 和F23偶联标记辣根过氧化物酶，然后进行竞争ELISA试验，结果发现8株单抗 针对HN蛋白上的四个不同抗原区．2G5、3A4、385和681属于同一抗原区，M22 扬州大学硕士学位论文 扬州大学硕士学位论文 和1=23同属于另一抗原区．8C5和lH6分别单独属于一个抗原区。针对同一抗原 区的单抗之间存在相互竞争，不同抗原区的单抗之间无竞争现象。 用具有HI特性的5株单抗，对我室保存的50多个NDV毒株进行排谱试验， 结果表明：2G5、3A4、385和681四株单抗的反应谱比较一致，但它们与8C5单 抗的反应谱明显不同。另外，五株单抗与鹅源NDV毒株的反应性较强，而与鸽源 NDV毒株的反应性较弱。 用单抗6131作为一抗，建立了IIFA方法，可以有效地进行NDV强毒株的检 测，而且特异性好。以不同的单抗包被酶标板，再与辣根过氧化物酶标记的不同 单抗进行交叉ELISA试验，筛选出了两个新的夹心ELISA系统，即M22．8C5和 2G5．8C5系统，然后与本室原来建立的M22．F23系统同时对NDV毒株排谱，发现 新建立的2G5．8C5系统对鸽源NDV毒株的反应性相对较弱，而与鹅源NDV毒株 的反应性较强，这与HI排谱试验结果相符，所以该系统可用于鹅源NDV的检测。 另外，三个系统对大部分NDV毒株的反应性比较好，而对于少部分毒株，不同的 系统对它们的反应特性不尽相同，但总的来说，M22．8C5系统能与所有的NDV毒 株反应，因此更适合于试剡盒的组建并显示出了相当好的应用前景。 关键词：鹅源NDV，单克隆抗体，血凝抑制，间接免疫荧光，ELISA。 胡顺林：基因VII型新城疫病毒单克隆抗体的研制、鉴定与初步应用 胡顺林：基因VII型新城疫病毒单克隆抗体的研制、鉴定与初步应用 3 Development and appfication of the monoclonal antibodies against genotype VII Newcastle disease virus M．S．candidate Shun／in Hu Advisots Prof Yantao Wu Prof．Xiufan Liu Abstract Since 1997，the goose flocks in some regions of South and East China have experienced outbreaks ofNewcastle disease virus(NDV)infection．The results of the in vitro tests indicate that the go