基因重组大肠杆菌以不同碳源合成l苯丙氨酸的比较-营养与食品卫生学专业论文.docxVIP

原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其它个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者：农绝弱 日期： 2010年6月5日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其它复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者：钰耄色诲 日期： 2。1。年6月5日 摘要摘 摘要 摘 要 L广苯丙氨酸(L．Phenylalanine，L-Phe)是人体的一种必需氨基酸，对人体 具有重要的作用。目前，由于甜味剂阿斯巴甜(aspartame，AMP)、氨基酸类抗 癌药物及营养保健品的生产和应用，使L．Phe的市场需求量大大增加。但是国 内仅有的几个L．Phe的生产企业，规模都比较小，产酸率也只有8％左右，靠 国内生产的L-Phe不能满足市场需求，所以国内应用的L-Phe主要靠进口。为 促进以L广苯丙氨酸为原料的产业的发展和降低我国的经济负担，大力开发和完 善L广苯丙氨酸的发酵生产技术和工艺，实现规模化工业生产，是十分有必要的。 目的 1．以大肠杆菌MGl655为宿主菌，将含有相同质粒的营养缺陷型菌株在分 别以甘油、葡萄糖、甘油和葡萄糖的混合物为碳源的培养基中进行发酵，比较 不同碳源对细菌生长及L-Phe产量的影响。 2．将不同质粒分别在野生型菌株和营养缺陷型菌株中表达，并在同等条件 下进行发酵。在发酵结束时，比较不同质粒在两种菌株中的生长情况和L-Phe 的产量差别，筛检出高产菌株。 方法 1．采用入．Red重组的方法将野生型MGl655染色体上的pheL、phcA、tyrA 和aroF四个基因敲除，获得营养缺陷型菌株MGl655△aroF。 2．通过定点突变和multiplex PCR等技术，以pZEl2为载体构建不同的基 因型质粒。 3．将基因重组和野生型菌株分别在以甘油、葡萄糖、甘油和葡萄糖混合液 (甘油和葡萄糖以质量比3：2的比例混合)为碳源的培养基中培养。用十二烷 基硫酸钠．聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)检测发酵过程中分别由pheA、aroF 和aroG编码的蛋白酶的表达情况。将蛋白酶高表达的菌株进行发酵。 4．发酵过程中，用薄板层析法粗测L-Phe的产量；发酵结束后，用氨基酸 自动分析仪测定发酵液中游离L-Phe的含量。 结果 1．同一基因型大肠杆菌分别在以葡萄糖、甘油、甘油与葡萄糖混合物为碳 源的培养基中发酵。结果显示细菌在葡萄糖中生长最慢，在混合培养基中进入 摘要对数期较晚，L-Phe在甘油中的产量高于在葡萄糖和混合碳源中的产量，最高 摘要 对数期较晚，L-Phe在甘油中的产量高于在葡萄糖和混合碳源中的产量，最高 可达两倍。 2．将本实验中所构建的6个基因型分别在营养缺陷型大肠杆菌菌株和野生 型菌株中表达，并在甘油中发酵。结果显示在pheA和aroG串联表达的基因型 中，pZEl2pheA仿rfll-oGM(pZEl2Ar。rGM)合成L-Phe的能力最强， 而 pZEl2pheAaroG(pZEl2AG)的最弱；在pheA和aroF串联表达的基因型中， pZE 1 2pheAnraroF(pZE 1 2AarF)合成L-Phe的能力大于pZE 1 2pheAaroF (pZEl2AF)。同一个基因型质粒在MGl655中的生长速度比在MGl655AaroF 中快，但是在MGl655中的L-Phe产量低于MGl655AaroF。 结论 1．pZEl2AFMG A aroF、pZEl2AebrFMG A aroF、pZEl2AGMG／k aroF、 pZEl2AGMMGAaroF、pZEl2Am‘GMGAaroF和pZEl2An。GMMGAaroF在甘油 中的生长趋势和合成L．Phe的能力均比在葡萄糖中的好。 2．pheA和aroG的抗反馈抑制体，可以增强大肠杆菌合成L-Phe的能力。 3．MGl655有利于细菌的生长，但是合成L．Phe的能力比MGl655AaroF 低。 关键词：L．苯丙氨酸代谢工程基因重组酪氨酸营养缺陷型菌株甘油 U Abstrac