基因治疗用于半月板损伤的实验研究-外科学(骨科)专业论文.docxVIP

上海交通大学2003级博士学位论文第一部分、半月板细胞的分离与培养 上海交通大学2003级博士学位论文 第一部分、半月板细胞的分离与培养 目的：探讨分离培养半月板纤维软骨细胞的有效方法和效能；观察体 外培养的半月板纤维软骨细胞的生物学特点。 材料与方法：严格无菌环境下切取新西兰大白兔膝关节半月板，洗涤 后剪碎，先后用胰酶(O．25％)和胶原酶(O．3％)进行消化，然后过 滤离心，细胞沉淀重悬后检查细胞存活率，进行原代细胞培养和传代。 记录细胞生长数量，细胞增殖，细胞周期和胶原合成情况。 结果：分离的半月板纤维软骨细胞存活率大于95％，半月板细胞体外 培养生长良好，传代顺利，可以传至6代以上。 结论：应用胰酶、胶原酶联合消化法能成功分离出半月板纤维软骨细 胞，分离的半月板细胞体外培养时能正常生长，保持纤维软骨细胞的 特性。 第二部分，携带bFGF基因的重组慢病毒载体的构建 目的：探讨构建携带特定生长因子基因的重组慢病毒载体的有效方 法。 材料与方法：利用RT-PCR反应从组织中获得碱性成纤维细胞生长因 子(bFGF)基因cDNA全长，与真核表达质粒pLenti6N5．D．TOPO 进行连接。将连接后的重组质粒在大肠杆菌中进行扩增。随后， 将连接后的重组质粒与包装质粒混合一起在293细胞液进行重 组慢病毒的构建，检测构建的慢病毒载体。 结果：经琼脂糖凝胶电泳检测所扩增的bFGF基因cDNA条带， 上海交通大学2003级博士学位论文” 上海交通大学2003级博士学位论文 ” 利用直接测序法验证bFGF基因与真核表达质粒 pLenti6N5．D—TOPO正确连接，重组慢病毒载体构建成功。 结论：bFGF基因能有效地与真核表达质粒pLenti6N5一D．TOPO 进行连接，连接后的质粒可以和包装质粒成功构建重组慢病毒。 第三部分、重组慢病毒载体转染单层培养的半月板细胞 目的：观察重组匣病毒载体转染分离培养的单层半月板细胞的效能以 及半月板细胞对bF(疆基因转染的反应。 材料与方法：当第一代半月板细胞培养到60％融合时，洗涤后与重组 慢病毒载体悬液共培养。同时设立对照组和空白组，对照组是与单纯 慢病毒共培养后的半月板纤维软骨细胞；空白组是未经任何特殊处理 的半月板纤维软骨细胞。检测各组半月板纤维软骨细胞的细胞增殖、 细胞周期和胶原合成情况。 结果：与重组慢病毒载体悬液共培养48h后，半月板纤维软骨细胞培 养液中可以检测到bFGF的表达，细胞增殖和胶原合成能力明显高于 对照组和空白组细胞(P0．01)。 结论：克隆有bFGF基因的重组慢病毒载体能有效转染培养的单层半 月板纤维软骨细胞，促进细胞增殖和胶原合成。 第四部分、重组慢病毒载体预处理待移植的半月板 目的：探讨异体半月板移植的作用及改善异体半月板移植预后的方 法。 上海交通大学2003级博士学位论文材料与方法：以新西兰大白兔为实验动物，将构建的克隆有bFGF基 上海交通大学2003级博士学位论文 材料与方法：以新西兰大白兔为实验动物，将构建的克隆有bFGF基 因的重组慢病毒载体与完整的半月板共培养后进行异体移植。同时设 立对照组和空白组，对照组为移植未与重组满病毒悬液共培养的半月 板，空白组为半月板缺失组。在移植术后第2、4、8、16周分别从实 验组、对照组及空白组采集移植的半月板及关节软骨，进行组织学切 片观察移植半月板的愈合情况、半月板下关节软骨的变化；用透射电 镜观察细胞。并对移植的半月板标本进行免疫组化检测和生物力学检 测。 结果：与重组慢病毒共培养后的半月板移植后与比邻关节囊愈合时间 提前，移植后4周就出现愈合，而对照组移植后8周才出现愈合；接 受重组慢病毒预处理的半月板的生物力学强度高于对照组(P0．05)。 没有接受异体半月板移植的膝关节的关节软骨出现随时间延长愈发 明显的退行性改变。 结论：异体半月板移植能有效防止半月板缺失膝关节软骨的退行性改 变，bFGF基因转染能促进异体半月板移植的愈合，改善异体半月板 移植的预后。 通过本课题的研究，我们发现慢病毒载体能有效地将bFGF基因 转染至培养的半月板纤维软骨细胞；bFGF基因转染能促进半月板纤 维软骨细胞的增殖和胶原合成功能。异体半月板移植能有效防止关节 软骨的退行性改变；bFGF基因转染能改善异体半月板移植的预后。 关键词：基因，碱性成纤维细胞生长因子，半月板，实验 上海交通大学2003级博七学位论文唧EXPERIMEN，】[：AL 上海交通大学2003级博七学位论文 唧EXPERIMEN，】[：AL STUDY oF GENE THERAPY ON MENISCUS INJURY ABSTRACT Being one of the important structures of the knee joint，meni