基因工程人巨细胞病毒pp150抗原试剂盒的制备及其初步应用-病原生物学专业论文.docxVIP

导师和课题组成员介绍导师：孟红 导师和课题组成员介绍 导师：孟红 女，45岁，研究员。从事医学病毒学研究20多年，主要从事病 毒疫苗、疫苗佐剂和病毒诊断试剂的研制抗病毒抗生素的研制。成功克隆腺病毒 载体乙肝疫苗，动物实验证明该疫苗黏膜免疫可获得较强的体液免疫和细胞免疫 效果：研究了一种疫苗佐剂，发现了高效抗人巨细胞病毒活性物质，有望获得自 主知识产权；克隆表达数种病毒检测抗原，并拥有稳定的商品化ELISA检测技术。 90年代以来，承担省级课题12项，国家自然基金1项，山东省刊技进步二等奖 1项，三等奖3项，院级奖励6项。 课题指导小组成员：刘菊华女，59岁，研究员，从事病毒学技术工作30多年， 参与完成省级课题20项，获得科技进步奖若干项。 课题指导小组成员：岳盈盈女，27岁，研究实习员。从事医学病毒学研究3 年。 课题指导小组成员：李志会男，27岁，研究实习员。从事医学病毒学研究2 年。 学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中引用 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中引用 他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的 任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东省医学科学 院。山东省医学科学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权 利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单 位仍然为山东省医学科学院。 沧文作者签名： 立：l查1 日期：迸年上Jq—t aI：：I 导师签名：—弓耄乏L1 ， 日期：—吐二年4月]L日 基因工程人巨细胞病毒PPl50抗原试剂盒的制各及其初步应用研究生：刘杰 基因工程人巨细胞病毒PPl50抗原试剂盒的制各及其初步应用 研究生：刘杰 导师：孟红 专业：病原生物学 中文摘要 目的： 原发性人类巨细胞病毒(HCMV)孕期感染胎儿80％可出现智力低下，视力、听 力损伤，严重者引起流产、死胎。免疫抑制患者感染HEMV可导致间质性肺炎，死亡 率高达75嘣”。孕期活动感染可导致胎儿畸形，因此HCMV早期检测具有重要的临 床意义。 临床上诊断HCMV早期和近期感染主要依据ELASA检测IgM抗体【241，检测试 剂的稳定性和特异性决定着检测结果的可靠性，因此要求所包被的抗原具有抗原性 强、特异性好的特点。目前国内临床采用的试剂盒基本为国产试剂，一般用细胞增殖 病毒的方法获取抗原。由于病毒生长和抗原表达的差异，再加上混有成纤维细胞成分， 易导致检测结果不一致和假阳性【5“】。 随着基因工程技术的发展，基因工程抗原逐渐代替传统的抗原广泛的应用于各种 检测。基因工程抗原结构单纯，性质稳定在检测中可以避免提高反应的敏感性，特异 性，稳定性并且易于标准化，更为安全。但由于一直未能找到具有较强的IgM反应原 性和特异性的抗原，检测HCMV的ELISA试剂国内一直没有被基因工程抗原完全取 代。 本项研究的主要目的是用基因工程方法表达HCMV抗原性较强并且具有IgM特异 性反应的蛋白片段，以重组抗原代替传统的病毒检测抗原，以提高检测的特异性，敏 感性，降低检测成本，促进病毒检测的发展。 方法： 根据genebank所查的HCMV PPl50基因和相关文献选取IgM特异性反应的基因 片断，全基因合成后构建克隆载体，PCR扩增目的基因，将PCR产物切胶回收后与 pET-30a载体连接，转化DH5 a，筛选。对阳性菌落测序后将带有目的基因的质粒转 入BL21菌株IPTG诱导表达，SDS．PAGE检测蛋白的表达，用westen方法鉴定蛋白 抗原性，纯化抗原用交叉连续稀释分析法滴定抗原滴度，然后包被酶标板制作试剂盒， 与传统抗原制做的试剂盒、PCR试剂盒比较其阳性符合率、阴性符合率，并用新制作 的试剂盒对献血员血清标本进行检测，初步分析了济南地区血库供血HCMV污染概况。 结果： 1、工程菌表达的目的蛋白具有预期抗原活性。 2、用基因工程抗原制做的试剂盒与传统抗原制作的试剂盒比较：阳性符合率80％， 2、用基因工程抗原制做的试剂盒与传统抗原制作的试剂盒比较：阳性符合率80％， 阴性符合率96．67％；与PCR试剂盒比较：阳性符合率96．67％，阴性符合率86．67％。 基因工程抗原制做的试剂盒与PCR试剂盒有较高的阳性符合率，比传统抗原制作的试 剂盒特异性较高。表明基因工程抗原试剂盒敏感特异。稳定性试验结果表明我们建立 的试剂盒稳定可靠，易于4℃长期存放、相对较高温度的短期存放(如运输等)，利于 推广使用。 3、济南地区献血员HCMV感染率是2．