光谱分开析技术.ppt

非光谱分析：基于物质与辐射的相互作用，测量辐射的某些性质，如折射、散射、干涉、衍射和偏振等变化的分析方法 光谱分析涉及“颜色”“谱”“能量”的变化 非光谱分析涉及光的传播方向等物理性质的变化，不涉及“谱” 光子：能量E、普朗克常数h、电子伏特eV h = 6.626 ×10-34 J·s 1J = 6.241 ×1018 eV Ｅ= hγ= hc/λ 解：1 eV = 1.602 × 10-19 J 根据公式Ｅ= hc/λ 则λ= hc/Ｅ = （6.626 ×10-34 × 3 × 108 ）/ （20 × 1.602 × 10-19 ） = 0.62 × 10-7 m = 62 nm 什么是紫外-可见光谱 什么是紫外-可见分光光度法 基本原理 基本原理 基本原理 基本原理 基本原理 ELISA原理图 Hitachi F-7000 2.3荧光在核酸研究中的应用—分子信标 可以发出各种颜色荧光的荧光蛋白 荧光的淬灭 荧 光 淬 灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。 荧光淬灭剂：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光淬灭剂（如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基/羰基/羧基化合物等）。 荧光能量共振转移（FRET） 能量共振转移（FRET） Fluorescence Resonance Energy Transfer 相互作用的研究 荧光分光光度计 光源 氙灯 激发单色器 样品池 光电倍增管 数据处理 仪器控制 光源 样品池 激发 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 发射 单色器 发射单色器 问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？ 紫外-可见分光光度计: 光源 样品池 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 荧光(磷光)分光光度计: 光源 样品池 激发 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 发射 单色器 荧光分光光度计 荧光分光光度计 样品池 1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样 2. 吸收池的形状： 紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光 荧光分光光度计的样品池四面透光 问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？ 荧光分光光度计 紫外-可见分光光度计测量池(吸收池) 荧光分光光度计 样品池 I0 It I0 It IF,p 荧光分光光度计 荧光光谱的应用 芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定的主要类型。 1. 有机化合物的鉴定 0.001~0.033 470 395 3-乙酰氧基吲哚 玻璃酸梅 0.05~5 470 365 邻苯二醛 胍基丁胺 0.0625~0.625 500 420 α-甲氧基-６-氯-９-(β-氨乙基)-氨基氮杂蒽 青霉素 0.01~50 425 315 氧化酶 氨基酸 1.5~15 505 465 蒽酮 糠　醛 0.06~6 540 紫外 曙红丫 蛋白质 10-4 485 365 苯二胺 四氧嘧啶 0.001~0.02 525 420 乙二胺 肾上腺素 0~20 490 345 无水乙醇 维生素A 0.1~2 蓝色 紫外 苯胺 丙三醇 测定范围 ppm λemmax λ exmax 试剂 待测物 荧光光谱的应用 2. 分子标记与追踪 　在生物学研究中，科学家们利用能发光的荧光分子对生物体进行标记。将荧光分子通过化学方法“挂在”其他“不可见”的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。生物学家利用这种标记方法，把原本透明的细胞、细胞器或生物分子从黑暗的显微镜视场中“揪出来”。 量子点 （无机纳米粒子） 荧光染料 （有机小分子） 荧光蛋白 （蛋白质） 荧光光谱的应用 2.1荧光在核酸研究中的应用——电泳 Midori Green Ethidiumbromide 荧光光谱的应用 SYBR Green I 2.2荧光在核酸研究中的应用 实时定量荧光PCR（RT-qPCR） 荧光光谱的应用 Taq-Man 紫外-可见分光光度计 岛津 UV-2450 工作原理基仪器结构框图 光源 碘钨灯 氘灯 单色器 测量池 参比池 样品池 光电倍增管 数据处理和仪器控制 光源 样品池 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 紫外-可见分光光度计 紫外-可见分光光度计 单光束分光光度计 双光束分光光度计 紫外-可见分光光度计 吸收池的材料 玻璃 360 nm 2.25 mm 紫外-可见分光光度计 石英 200 nm 2.5 mm 紫外-可见分光光度计 吸收池的形状 可拆卸圆形测量池 两面透光 圆形测量池 两面透光 1cm 长方形测量池 两面透光 气体测量池 两面透光 微量测量池