生物制药工艺学第12章制备型笔hplc.ppt

第十二章 制备型高效液相色谱 制备型高效液相色谱的用途： 1重组蛋白药物生产的工艺优化、中试以及大规模生产的必备手段。 2天然产物中活性物质发现的重要手段: 蛋白质,多肽,多糖。抗菌肽 3从天然产物来源药品生产的重要手段：胰岛素，蕲蛇酶。 4实验室制备样品用于临床试验和报批。 5 在 2-D 电泳, blotting, ELISA 等之前的样品制备。 第一节 高效液相色谱法简介 1.1 液相色谱的发展史 1903年，色谱法问世。 俄国植物学家茨维特 1903年3月21日， 大会报告 “一种新型 吸附现象及其在生化 分析上的应用” 1906年 在德国植物学杂志发表 文章，首次命名上述分 离后色带为色谱图，称此方法为色谱法 1931年，库恩（Kuhn）分离胡萝卜素，1938年，Kuhn和Lederer从维生素B中分离出B6，获得了1938年的诺贝尔化学奖。 1941年，马丁（Martin）和辛格（Synge）提出液液分配色谱法，1952年度的诺贝尔奖。 60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的成功研制 高效填料，高压泵，仪器检测 1.2 基本仪器装置 输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 收集系统 数据处理系统 检测系统： 收集系统： 数据处理系统： 三、高效液相色谱法的特点 采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检测器, 从而实现了高效、高速、高灵敏度和定量准确。 和经典液相相比有以下优点：快速、灵敏度高、分辨率高、自动化程度高 等。 四、制备型高效液相色谱与分析型高效液相色谱法的区别 输液泵不同： 两种泵设计的特点及其性能 检测器中的检测池不同 ： 体积不同 色谱柱不同： 规格主要是直径，粒径的大小 制备色谱一般配有电导检测器和pH值检测器分析型色谱没有： 制备色谱一般配备收集器分析型色谱没有 五、色谱的基本理论及有关参数 两大理论： 塔板理论(the plate model):阐明了色谱、蒸馏和萃取之间的相似性，将色谱柱设想成由许多液液萃取单元或理论塔板组成；相似于精馏过程，色谱分离也是一个分配平衡过程 . N = 16 (tR / wb)2 N = 5.54 (tR / w1/2)2 速率理论:研究各种动力学因素对峰展宽的影响。 H= A+Cu 有关参数 容量因子：溶质在固定相中的总摩尔数与流动相中总摩尔数之比。容量因子k与柱效参数及定性参数密切相关，而且比分配系数易于测定，在色谱分析法中一般都是用容量因子代替分配系数。 选择因子（selectivity factor,α）： 相邻两组份的分配系数或容量因子之比。设k2k1，则α＝k2/k1，所以α又称为相对保留时间（《美国药典》）。要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组份在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。 分离度：在色谱过程中表示两组分相互分离的程度,一般情况下,分离度大于1.5时称分离完全. 只有峰窄而间距大的分离是令人满意的。 在色谱分析中要求： 两组分的保留值差别要足够大。 两色谱峰要足够窄。 待测组分的分离度要足够大，分离过程要尽可能短. 六、制备型高效液相色谱的重要参数： Capacity:纯化过程中，目标物质的上样量。可以是体积也可以是质量。 Speed:在除去蛋白酶的过程中此项非常关键。 Recovery:产品贵重时此项很重要。流动相的条件、环境会影响它。减少步鄹和保持一种对生物样品合适的环境条件。 Resolution:在纯化的最后阶段，此项很关键，尤其是杂质的结构和目的物结构相似时。 七、分离机理和色谱类型 分离蛋白质类物质时的分离依据： 疏水性 分子大小 等电点 结构特异性 色谱介质按分离机理分为 正相色谱： 反相色谱：常加入TFA 离子交换色谱：阴离子交换色谱（DEAE二乙基氨基乙基，Q季胺盐）阳离子交换色谱（CM羧甲基S磺酸基） 凝胶过滤色谱： 疏水色谱：苯基，辛基等。 金属螯合色谱：镍、铜等 亲合色谱 : 第二节 分离方案的设计 What is the intended use of the product? What kind of starting material is available and how should it be handled? What are the purity issues in relation to the source material and intended use of the final product? What has to be remov