基因芯片在直结肠癌远处转移中的应用-外科学(普外)专业论文.docxVIP

贵阳医学院 贵阳医学院 2011 届硕士研究生学位论文 3 3 PAGE PAGE 10 基 因 芯 片 在 直 结 肠 癌 远 处 转 移 中 的 应 用 专 业 ： 普 通 外 科 学 研 究 生 ： 王 国 栋 导 师 ： 颜 登 国 教授 主 任 医 师 摘 要 目的：研究人直结肠癌远处转移相关基因的表达，探讨肿瘤转移发生机制。 方法：选取 8 例有远处转移直结肠癌肿瘤组织（任何 TNM1 期），8 例无远处转移 直结肠癌肿瘤组织（Tis～T N2M0 期），利用 Affymetrix 公司的 Titan16 张全人 表达谱芯片对两组的基因表达谱进行分析。 结果：与无远处转移组相比，有差异表达的基因共 174 条，其中 50 条基因表达 显著上调，124 条基因表达显著下调。 结论： 运用基因芯片技术可以快速、高通量、高敏度的筛查与直结肠癌远处转 移相关的基因；直结肠癌的远处转移与机体免疫功能低下或受抑制有明显关系。 同时癌基因的过度表达与抑癌基因的抑制都会诱发肿瘤远处转移。 关键词：基因芯片；直结肠癌远处转移；差异基因 1.前言： 基因芯片又称 cDNA 微阵列(cDNA microarray)是近年发展起来的一项 DNA 分 析技术,一般包括寡核苷酸芯片和 cDNA 芯片 2 种,其基本原理是在固相载体上按 照特定的排列方式固定上大量已知的 DNA 片段,形成 DNA 微矩阵,将样品 DNA/RNA 通过 PCR/RT-PCR 扩增、体外转录等技术渗入荧光标记分子后,与位于芯片上的已 知序列杂交,最后通过扫描仪及计算机进行综合分析,比较不同荧光在各点阵的 强度,即可获得样品中大量基因表达的信息。基因芯片在一张微小的芯片上能够 在同一时间内平行分析大量的基因,进行大量信息的筛选和检测分析。结直肠癌 是临床最常见的恶性肿瘤之一, 易发生血行、淋巴转移和肝转移。目前尽管治疗 措施不断改进,但术后 5 年生存率仍在 50%～55%。治疗失败的主要原因是术后的 复发和转移。与肿瘤的发生一样, 转移是一个多步骤、多因素、序贯的复杂过程, 涉及到多种基因及产物的异常变化和相互作用, 多种信号通路相互调节和拮抗 [1] 。因此, 深入了解肿瘤转移的分子机制是研究肿瘤侵袭转移的重要内容。本 研究应用全基因组功能芯片比较结直肠癌转移灶和原发灶间基因表达谱差异, 寻找与肿瘤转移相关的转移促进基因和转移抑制基因。 2.材料与方法： 2.1 标本采集 选取贵阳医学院附属第一医院肛肠科 2010 年 4 月～10 月手术切除、病理检 查证实的直结肠癌患者 16 例(见表 1) ,其中:男 6 例,平均年龄 70.3 岁,女 10 例, 平均年龄 59.7 岁。每例于标本离体后立即取新鲜肿瘤组织 3-5g,入液氮冷冻保 存备用。所选用病例术前均未经放疗和化疗,且经组织学检查证实。其中 M 远处 转移的诊断标准为术前影像学检查和术中探查结果。 2.2 主要试剂和设备 本研究采用试剂主要包括 TRIzol 试剂盒（Invitrogen 公司）、RNeasy Mini 试剂盒（Qiagen 公司）、mRNA 纯化试剂盒（Qiagen 公司）、RNA 转录标记试剂 盒（Affymetrix 公司）、基因芯片杂交炉 640（Affymetrix 公司）。设备主要 包括基因芯片流程工作站 400（Affymetrix 公司）、基因方阵扫描仪 3 0007G （Affymetrix 公司）、QuantiTect SYBR 基因逆转录 PCR 仪（Qiagen 公司）等。 其它还有高密度寡核苷酸芯片 Affymetrix Titan16 张全人表达谱芯片，代表人 类全基因组 38 000 转录本，具有 54 000 个短寡核苷酸探针。 2.3 主要分析软件及数据库 主要包括 GCOS 分析软件包(Affymetrix 公司)，Dat.view 1.0 软件，NCBI 数据库，Entrez 数据库和 GDB 数据库等。 2.4 样品制备 用 Trizol (Invitrogen，Gaithersburg，MD，USA)法抽提组织总 RNA。抽提 所得总 RNA 经 Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)电泳质检合格后备用。并以采用 Affymetrix 表达谱芯片配套试剂盒， GeneChip 3’IVT Express Kit(Affymetrix, Santa Clara, CA, US)和标准操作 流程对样品总 RNA 中的 mRNA 进行放大、标记和纯化，获得带有生物素(biotin) 标记的 cRNA。配制杂交液。 2.5 杂交和洗涤 用经分光光度计