单点突变蛋白特异的RNA适配体筛选及功能研究-生物化学与分子生物学专业论文.pdf.docxVIP

研究生优秀毕业论文 中国科学技术大学学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰 写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了 作者签名： 醯 明确的说明。 签字日期： 丝啦￡!望 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学 拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构 送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入 《中国学位论文全文数据库》等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 啦仫开 口保密(——年) 作者签名：陋：i尧 导师签名： 卑并 签字日期：迦!芏!￡：兰翌． 签字日期：渔!堇：!：．帮 万方数据 摘要摘要 摘要 摘要 p53蛋白，也被认为是肿瘤的抑制蛋白。自从发现以来，被证实参与细胞周 期调控，激活DNA修复、维持基因组稳定及促进细胞凋亡。在超过50％的人类 的癌症中都出现p53功能缺失，其中就包括单位点和多位点的突变及结构的扭 曲。同样也有越来越多的研究证实，p53蛋白的突变，使得其空间构象发生变 化，从而失去对细胞周期调控与促进细胞凋亡的重要生物学功能，与此同时， 还会得到新的功能(Gain—of-Function，GOF)，如促进细胞转移、侵染等，由 抑癌基因变为癌基因。目前越来越多的研究组开始关注p53蛋白突变体的研 究，其中就包括促进突变体的回复突变及抑制其生物学功能。此项研究对于癌 症的靶点治疗具有重要的生物学研究与医学价值。 核酸适配体(aptamer)是一段短的单链核酸分子，其特点是能够根据结构 特异性针对性地地结合多种靶标分子，如蛋白质、小分子、糖、脂肪等。它是 由一个叫 SELEX (SystematiC Evolution of Ligand Exponential enrichment)的体外筛选进程得到的。SELEX技术自从1990年由三个研究组同 时发明并已广泛地运用到诸如核糖体开关、靶向治疗等生物及医学应用。于是 我们有理由相信，通过此筛选方法，我们也可以筛选到对诸如p53突变体有高 亲和力和特异性的核酸适配体。 目前，还未见研究组筛选到p53突变体适配体的报导。在本论文中，我们 的首要研究目的就是能够筛选到p53R175H的适配体。由于此突变型与野生型的 唯一区别只在于第175位的氨基酸突变，所以我们对传统的SELEX筛选过程进 行了改进，名为差别竞争SELEX筛选，将p53野生型与突变型蛋白质分别经过 固相偶联，同时投入体系中，竞争性地结合库分子，最大限度地增加筛选特异 性与差异性。经过5轮的差别竞争SELEX筛选，我们得到了21个p53R175H蛋 白的候选适配体。通过亲和力检测，适配体p53R175H—APT与p53R175H蛋白的 亲和力大大超过对于野生型p53的亲和力，并且在凝胶迁移实验中我们最终确 定p53R175H-APT能够在体外和p53R175结合。所以我们最终确定的p53R175H— APT作为我们后续研究的对象。 尽管在亲和力检测中，p53R175H-APT对于p53突变体有着相对于野生型 p53较强的亲和力，但其细胞学效应还有待研究。在本论文中，我们试图阐述 筛选到的适配体p53R175H—APT在细胞中的功能。首先，我们必须确定 p53R175H—APT在其靶标的选择上具有严格的特异性。在含有p53野生型的 HEK293T和HeLa细胞中，通过将p53R175H-APT转染入上述两种细胞中，无论 从表型还是从细胞生长于凋亡的情况看，均没有发现与对照组有显著性差异。 万方数据 摘要同时，在只含有p53的另一个突变体p53R273H的H1299细胞中，经过转染 摘要 同时，在只含有p53的另一个突变体p53R273H的H1299细胞中，经过转染 p53R175H—APT，相对于对照组我们依然没有观察到明显的差别。在完成了以上 实验证实p53R175H—APT对于含有p53野生型与p53其他突变体的细胞没有显著 性作用之后，我们将此适配体构建到质粒并转染入H1299一p53R175H稳转细胞系 中，我们发现，经过p53R175H-APT处理的细胞，细胞增殖得到明显的抑制，细 胞的死亡明显增多。而对于含有p53野生型的细胞，则没有此现象。侧面说明 此RNA适配体可以特异性地识别p53R175H并显