精原干细胞(sscs)的建系及蛋白质组学分析-生殖医学专业论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 研究生优秀毕业论文 南京医科大学博士学位论文目 南京医科大学博士学位论文 目 录 中文摘要 1 ABSTRACT 一4 第一部分：小鼠精原干细胞系(SSCs)的建立 7 实验材料与方法 9 一、实验材料 一9 实验内容与结果 ．．32 一、新生1周小鼠睾丸性原细胞细胞迁移及增殖启动时间点确立 32 二、ACTB．tdTomato小鼠SSCs细胞系的建立及生化鉴定 34 三、Stra8．EGFP小鼠SSCs细胞系建立及鉴定 36 四、ACTB．GFP SSCs的分离培养及鉴定 ．38 五、SSCs分化潜能鉴定 ．．41 讨{仑 ．．46 第二部分：SSCs细胞系的应用 47 实验材料与方法 一50 一、实验材料 50 二、实验步骤与方法 54 实验内容与结果 ．．60 一、Stra8．EGFP SSCs与新生小鼠睾丸体细胞异位重构睾丸微环境 ．60 二、CRISPR．Cas9系统对ACTB．GFP SSCs进行基因编辑 62 讨{仑 ．．65 第三部分：小鼠精原干细胞系的蛋白质组学研究 ．67 实验材料与方法 ．．69 一、实验材料 69 二、实验步骤与方法 70 实验内容与结果 一78 万方数据 南京医科大学博士学位论文一、 南京医科大学博士学位论文 一、SSCs蛋白质组学分析 ．．78 二、相关基因的验证及深入研究 81 讨{仑 ．．85 参考文献 ．88 综述：精原干细胞的特性以及其临床应用的价值 ．94 攻读学位期间发表文章情况 11 1 致谢 1 14 万方数据 南京医科大学博士学位论文中文摘要 南京医科大学博士学位论文 中文摘要 近年来，不孕不育己成为日益严重的社会问题。其中，由于男性因素导致 的不育约占到不孕不育总数的一半。2010年诺贝尔生理医学奖颁给英国科学家 罗伯特·爱德华兹(Robert Edwards)，以表彰其在辅助生殖技术，特别是体外人工 受精(In vitro fertilization，IVF)疗法上的卓越贡献。目前，全球超过10％的不育症 夫妇通过辅助生殖技术得到健康的子女。但是，由于技术的限制，包括IVF，卵 胞浆内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)在内的辅助生殖技术都 要求夫妻双方提供成熟且健康的配子。因此对于无精子症导致的男性不育患者， 由于没有成熟的雄性配子，不能接受辅助生殖的治疗，目前唯一的解决方式是 借助精子库的精子受精，因而不能够得到生物学意义上的子代。而在无精子症 患者中，真正的唯支持细胞综合征患者只占到17％，大多数患者睾丸中仍存在 正常的精原干细胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)。SSCs是睾丸中维持雄性 哺乳动物精子发生的成体干细胞，它一方面具有自我更新的能力，另一方面又 可以分化出可以进行减数分裂的生殖细胞，最终形成雄性配子。因此SSCs具有 临床治疗无精症的潜在价值。 在基础研究中，SSCs不但可以作为研究干细胞增殖分化研究的平台。更重 要的是，SSCs在基因编辑，获得转基因小鼠上，有着不可替代的优势。由于SSCs 所分化出的单倍体雄性配子是遗传物质的直接携带者，因此在SSCs上进行转基 因操作再结合生殖细胞移植技术可以非常便利的得到带有转基因的雄性配子， 进而方便的得到转基因动物。同时，在对于雄性生殖细胞基因功能的研究中， 利用SSCs进行基因敲除，不但可以在体外培养时直接观察所研究的基因对于 SSCs增殖及自我更新的影响，更重要的是，通过SSCs的移植实验，可以直接 观察基因敲除的SSCs在迁移及后续分化，包括精母细胞减数分裂及精子变形中 的表型，比传统的构建基因敲除模型后观察其睾丸中的表型有非常大的便利。 万方数据 南京医科大学博士学位论文本研究针对 南京医科大学博士学位论文 本研究针对SSCs的这些特性和应用潜能，进行了深入的研究。具体分为三 个部分： 一、我们在体外建立了三株小鼠SSCs细胞系。这些细胞系均可以在体外长 期传代培养，仍维持增殖的能力。基因表达分析结果显示SSCs细胞系与体内 SSCs基因表达模式相同。将体外培养的SSCs移植N4,鼠睾丸的曲细精管中， SSCs能够在受体小鼠睾丸中定居，增殖，并进行了正常的精子发生过程。将移 植了SSCs的受体鼠与野生型母鼠交配或进行ICSI后，都可以得到正常出生的， 带有与SSCs相同的转基因标记的子代动物，证实这些经过体外多代培养的SSCs 具有良好的发育潜能。 二、针对SSCs在单倍体生成及转基因操作中的应用，本文进行了一些尝试。 传统方法中，要将在体外传代培养的SSCs进一步分化成单倍体的精子，需要将 其移植到受体小鼠曲细精管的微环境中。而在人类，将体外培养的细胞移植回 病人的睾丸