绿色巴夫藻多不饱和脂肪酸合成关键酶基因的克隆表达及功能研究-微生物专业论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 山东大学博士掌位论文绿色巴夫藻多不饱和脂肪酸合成中关键酶基因的克隆表达 山东大学博士掌位论文 绿色巴夫藻多不饱和脂肪酸合成中关键酶基因的克隆表达 及功能研究 摘要 多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)是指含有两个或两个以 上双键且碳链长为16．22个碳原子的直链脂肪酸，包括二十碳五烯酸(EPA)， 二十二碳六烯酸(DHA)等，其中EPA／DHA具有重要的生理作用如：营养强化， 调控脂类代谢，预防和治疗动脉粥样硬化和心血管疾病，调节机体的免疫功能， 调节视力和大脑发育，调节中枢神经系统功能，还可以开发为抗肿瘤药物。目前， 深海鱼油是EPA及DHA等PUFA的重要商业来源，然而仅仅依靠原有的鱼油资 源已经无法满足日益扩大的市场需求。另外，研究发现，鱼类并不是PUFA的真 正生产者，而是通过吞食富含PUFA的海洋微藻后在体内积累。海洋微藻是 EPA／DHA的初级生产者，而且从微藻中提取PUFA比生产鱼油工艺简单，产品 没有鱼腥味，胆固醇含量低。因此，利用海洋微藻生产PUFA成为获取EPA和 DHA的一种新的手段。但是海洋微藻多为自养藻，生长缓慢，细胞得率低，培 养过程中易染杂菌，另外对微藻的规模化培养及细胞改良等方面的研究尚处于实 验室阶段，所以利用微藻大规模提取生产EPA／DHA来满足社会需求还不现实。 PUFA的生物合成始于C18．PUFA：LA和A LA，通过一系列的脂肪酸脱氢 酶(fatty acid desaturase，FAD)的脱氢作用和脂肪酸碳链延伸酶(fatty aicd elongase，FAE)的碳链延伸作用逐步完成。FAD催化的脱氢反应是将脂肪酸链 中的C．C转化为C=C，每个FAD都在酰基链的特定位置引入双键；FAE是参与 C18、C22．PUFA的碳链延伸反应的一类延伸酶复合体，它催化供体(乙酰辅酶 A或丙二酰辅酶A)的两个碳原子引入PUFA碳链中增加其碳链长度。 随着对PUFA生物合成途径及调控机制研究的深入，从分子水平上研究微藻 PUFA合成的影响因素，通过对PUFA合成途径关键酶基因的克隆，实现基因的 异体高效表达，以期得到大量的PUFA，为解决EPA／DHA资源，降低生产成本， 提供一条新途径。而且FAD和FAE在植物基因工程，食品工程和发酵工程等领 域的广阔应用前景是毋庸置疑的，在上述领域的应用也将进一步促进对脂肪酸合 山东大掌博士拳位论文成途径的认识和研究。 山东大掌博士拳位论文 成途径的认识和研究。 本论文实验材料绿色巴夫藻(Pavlova viridis)为自养微藻，EPA和DHA含 量丰富，分别占总脂含量的16％和9％，是研究脂肪酸合成途径中相关脱氢酶和 延伸酶很好的实验材料。本文的工作和研究成果如下： 1．研究了培养温度、光照强度对只viridis生长及其EPA／DHA含量的影响， 优化培养条件。结果表明，P viridis的生长温度范围较广，在16℃~25℃均可生 长，但是低温(18℃)有利于藻体内EPA和DHA的积累，经气相色谱分析此条 件下的EPA和DHA含量分别为16．25％，9．226％，较25℃条件下提高了12．45 ％和8．226％。由此证实：尽管较高的温度有利于只viridis的生长，但此时不饱 和脂肪酸含量较低。P viridis为自养生物，当光照强度较弱时，该藻生长停滞， 此时的EPA和DHA含量较低；随着光照强度的增加，藻体生长加快，同时EPA 和DHA的含量也增加到16．62％和6．79％。通过GC／MS测定18(2光照培养条件 下户viridis的脂肪酸组成，发现只viridis不饱和脂肪酸种类齐全，含有多种不饱 和脂肪酸，是克隆脱氢酶基因和延伸酶基因很好的实验材料。 2．总RNA的质量直接影响到所建文库的优劣，本文在对比了Trizol试剂 法，异硫氰酸胍一步法，CTAB法等方法的基础上，摸索出一种适用于只v／r／d／s 总RNA提取的有效方法—CTAB和酸酚相结合的改良CTAB法。此方法可有效 去除RNA提取过程中多糖和多酚类物质的干扰，所得RNA质量较高。利用改 良的CTAB法提取P viridis总RNA，构建其eDNA文库，所建eDNA文库滴度 为6 X 106 pfu／mL，重组率达到98％，插入片段在250 bp--2．0 kbp之间，表明该 文库达到建库要求。通过表达序列标签(expressed sequence tags，ESTs)技术对 P viridis eDNA文库进行随机序列扩增和测序，将所得200条EST序列与 GenBank中已报道基因进行BLAST同源性比对，获得了许多功能基因的遗传信 息，为克隆基因全长和进一步开发微藻的新功能基因奠定了基础。经