双环醇对人肝癌细胞hepg2的周期抑制及自噬诱导作用的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得堂坚盘生或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 五茜 签字日期： 为后年易月口日 l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝垫态茔有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堂望盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 五西 导师虢参国 j 签字日期：弦岫年6月切日 签字日期：勿，‘年占 月加日 万方数据 致 致 谢 九年时光在启真潮畔度过。如今已到告别之时。 首先衷心感谢我的导师龚兴国老师和周耐明老师。两位老师都对我的科研 学习过程给予了我极大的帮助。尤其是龚老师，从我第一次来到实验室开始， 龚老师就一直给予我无私的帮助和悉心的指导培养。龚老师对科研严谨认真、 对专业孜孜以求的态度也使我留下了深刻的印象，使我终身受益。祝两位老师 身体健康 其次要感谢周亮、郦剑勇、汤甜甜、秦勇、唐鸿云、吉鹏飞、王远鹏、杨凡、 马妍、戴唯、王宏伟、张艺、沈舒滢、王震、刘奇章、聂颢、赵鑫、周梦露等实 验室师兄师姐师弟师妹对我科研与生活的帮助和支持。 感谢我一生的朋友张昊、李天韵、范毅，在我迷茫和焦虑的时候帮助我走出 困境。 特别感谢我的女友雷彩云，陪伴我度过了近三年多最难熬的时光并且提供 了一如既往的支持和帮助。本论文得以完成也依靠了她重要的贡献。 最后，感谢我的父母，养育我长大并且在近三十年的时间里对我鼎力支持、 成为我坚强的后盾。 感谢所有关心我支持我的人。 王或 万方数据 浙江大学博士学位论文 浙江大学博士学位论文 摘 要 摘 要 肝癌是全球第五大肿瘤疾病，具有极高的发病率及致死率。目前虽然在临 床上主要采取化学疗法、切除法、肝移植、免疫疗法等多种方法治疗肝癌，但是 在发达国家，肝癌疾病的生存率仅为3-5％，这促使人们不得不继续寻找新的治 疗肝癌疾病的方法。 双环醇(4．4’一二甲氧基一5。6。5’．6’一双(亚甲二氧基)-2-羟甲基一 2’ 一甲氧羰基联苯)为抗肝炎化学合成新药，在临床上已被广泛应用于治疗 HBV感染。此外，一些研究证明双环醇还具有提高肝功能、保护肝脏免受化学 物毒害的作用；同时也有研究发现双环醇可以诱导肝癌细胞中热休克蛋白 HSP27／70的表达，从而抑制细胞线粒体途径的凋亡。但是，对双环醇的抗肿瘤 效果以及双环醇在肿瘤细胞周期与自噬方面功能的研究仍少有涉及，而相关文 献中对双环醇作用后的癌细胞进行高通量筛选差异表达基因等初步研究表明双 环醇具有作为抗癌药物的潜能。因此本研究重点探索了双环醇对HepG2细胞的 毒性作用，并且在体外和体内环境探究了双环醇对肝癌细胞作用的分子机制。 结果如下： 1．双环醇显著抑制HepG2细胞增殖，而对正常肝细胞L02的毒性很低。MTT 实验表明，双环醇对HepG2的IC舯值为L02细胞的三分之一。而通过流式细胞 术研究发现，双环醇对HepG2细胞活性的抑制作用主要源于其能够抑制细胞周 期以及诱导细胞产生自噬，而在双环醇作用下的HepG2的凋亡水平没有发生变 化。在细胞周期方面，双环醇能够诱导HepG2细胞发生时间和浓度梯度依赖的 Gl期细胞阻滞。在细胞自噬方面，经过双环醇处理后，细胞内自噬标志蛋白LC3 I向LC3 II转化。另外，通过荧光显微镜对GFP-RFP-LC3转染细胞的观察和透 射电镜直接观察显示，细胞内自噬小体和自噬溶酶体的数量在双环醇诱导处理 后显著增加。这些结果说明双环醇通过抑制细胞周期和诱导细胞自噬，来抑制 HepG2的细胞活性。 万方数据 浙江大学博士学位论文 浙江大学博士学位论文 摘 要 2．双环醇同时抑制P13K／AKT通路和Ras／Raf／MEK／ERK通路。通过western blotting方法，证明双环醇影响了G1期调控相关蛋白的活性。双环醇能够诱导 p21廿九和p27n九表达，抑制CDK2-cyclinE和CDK4-cyclinD复合体水平，将Rb 蛋白去磷酸化导致细胞周期阻滞于G1期，同时本课题还发现双环醇通过抑制 mTOR蛋白活性诱导了细胞自噬。通过进一步研究周期与自噬相关上游信号通路， 发现双环醇显著抑制了AKT蛋白的磷酸化，下调了P13K／AKT