视黄醇结合蛋白7基因(rbp7)对大鼠肝再生的作用研究-生物学、细胞生物学专业论文.docxVIP

摘要视黄醇结合蛋白7(rbp7)又被称为胞内视黄醇结合蛋白4(CRBPIV)，主要运输胞内 摘要 视黄醇结合蛋白7(rbp7)又被称为胞内视黄醇结合蛋白4(CRBPIV)，主要运输胞内 视黄醇类物质。目前还没有关于rbp7基因在肝再生中作用的研究。本实验室采用基因 芯片Rat Genome 230 2．0检测再生肝中rbp7基因的表达情况，结果显示rbp7在肝再生 进展阶段(6．72h)的30h和72h基因表达上调，72h时达到表达高峰，这说明rbp7基因 是大鼠肝再生相关基因，为了进一步研究rbp7在肝再生中的作用，本文以大鼠再生肝 为材料，参照NCBI中rbp7的mRNA序列设计引物，采用分子克隆的方法克隆出厂助7 基因，并构建出了它的表达载体、干涉载体和检验载体。通过体外实验将 pEGFP-N1-rbp7、pEGFP-N1、pGenesil一1．O-rbp7(190)署H pGenesil-1．0-HK等4种质粒采 用脂质体转染法转入BEL一7402细胞内，用G418筛选出稳定转染细胞株，并进行以下 检测：采用活体观察和HE染色进行细胞形念观察；通过细胞计数和MTT法进行生长 曲线的测定：PCNA免疫组化检测细胞增殖；Hochest33258染色检测细胞凋亡；甲基纤 维素半固体培养基检测细胞的恶性增殖程度；药物MTT法检测细胞的耐药性，为进一 步研究r助7在肝再生中的作用奠定了基础，也为揭示肝再生分子机制提供信息。体内 实验采用液压转基因技术将质粒分别注入2／3肝切除大鼠体内，并检测转染这些质粒后 大鼠的死亡率、组织显微结构以及肝再生率，以判断rbp7对肝再生的影响。 结果发现，pEGFP．N1一r切7的细胞形态与BEL．7402细胞基本相同，但细胞核发生 固缩，变小：细胞的生长曲线显示在生长后期转染pEGFP．N1．rbp7的细胞比转染对照 pEGFP．N1的细胞生长要稍快些；PCNA和Hochest33258凋亡染色显示rbp7不会引起 细胞凋亡；甲基纤维素固体培养基实验显示pEGFP—N1．r助7可能增加了BEL．7402细胞 的恶性增殖程度：药物MTT检测则发现，rbp7基因对氨基酸衍生物L．4一氟苯丙胺酸无 明显的耐药性。体内实验表明，pEGFP—N1．rbp7组比对照PH组的肝再生率高，120h后 pGenesil．1．0-rbp7(190)组要比pEGFP．N1一rbp7组的肝再生率低。综上所述，肝再生相关 基因rbp7可能有促进细胞增殖、增加肝癌细胞恶性增殖程度和促进肝再生的作用。 关键词：肝再生，视黄醇结合蛋白7基因，肝癌细胞BEL．7402，稳定转染，肝再生率 ABSTRACTRetinol·binding ABSTRACT Retinol·binding protein 7(rbpZ)，also known intracellular retinol-binding protein 4(CRBPIV)， could participate in transporting retinoic alcohols．There is no research the role of rbp7 in liver regeneration until now．We detected the gene expression of rbp7 in liver regeneration with Rat Genome 230 2．0 Array,and found that rbp7 is upregulated at 30h and 72h in the advanced stage of liver regeneration (6—72h)，which indicated r@7 is related with rat liver regeneration．In order to clarify the effect of rbp7 liver regeneration，却7 gene was firstly cloned，and then its expression vector,interference vectors and test vectors were further constructed．In vitro experiments：the expression vector pEGFP-N 1．rbp 7 and its control pEGFP-N1，interference vector pGenesil 1．0-rbp7(190)and its control pGenesil．1．0．HK were stably transfected into human hepatoma cell