流式细胞术的重临床应用.ppt

移植免疫 四聚体 Tetramer-原理 内源性抗原 外源性抗原 Tetramer-原理 MHC Class I-HLA-A2 Tetramer-原理 Tetramer-原理 国外医学免疫学分册 2001；24(2):102-105 HLA Class I 限定性肿瘤抗原肽 抗原特异性CTL的分析方法 51Cr释放实验 PCR法 酶联免疫斑点法(ELISPOT) 扩增特异T淋巴细胞受体 Tetramer法 间接法 需大量的特异性CTLs作为效应细胞 需体外扩增，周期长，敏感性低， 费时费力 难以广泛应用 敏感性高 但只能用于已知TCR基因型的特异性CTLs检测 直接法 敏感性高 不受TCR基因型的限制 有限稀释法(LDA) 用Tetramer法研究表明，外周血中仅有0.2-2.5% 的CD8+细胞对CMV和EBV特异 Tetramer法 Doherty PC.The numbers game for virus-specific CD8+T cells[J]. Science,1998,280:227 了解病毒特异性CTL和记忆性CTL方面的一项革命 检测病毒特异性CD8细胞的金标准(Gold Standard) Tetramer-应用 感染性疾病 HIV-AIDS, EBV, CMV, HPV, HBV, HCV, Influenza, Measles, Malaria, TB and RSV Breast, Prostate, Melanoma, Colon, Lung, Cervical, Ovarian and Leukemia Diabetes, Lyme disease, Multiple sclerosis, Rheumatoid arthritis, Autoimmune vitiligo EBV and CMV 移植 自身免疫性疾病 肿瘤 感染性疾病 Tetramer-应用-例证 含有HIV-I型病毒包膜肽等三种抗原肽：HIV特异性CTL数量与血浆中RNA病毒量有明显的负相关，而与产毒性感染细胞的清除率无关 慢性HCV感染患者的特异性CTLs数量明显少于急性HCV感染和已康复患者 用黑色素瘤抗原诱导潜在的肿瘤特异性T细胞—用Tetramer分离，富集 GVHD(移植物抗宿主反应)：受体与供体的次要组织相容性抗原(mHags)的不同引起，在骨髓移植后早期出现(14天内)，造成骨髓移植失败---HLA-mHags肽四聚体监测mHags特异性CTL，以了解对GVHD的临床治疗效果 HLA-A2/pp65 Tetramer监测肾移植患者感染CMV后的免疫应答能力 移植 肿瘤 HLA-B27 通过CD3PEvsSSC设门，圈定CD3阳性细胞（T淋巴细胞），检测其B-27的平均荧光强度。如标本的平均荧光强度小于标准微球荧光强度则为阴性，反之为阳性。 Th1/Th2细胞 肿瘤学 细胞凋亡 * 流式细胞术在临床上的应用 深圳市人民医院临床医学研究中心 李富荣 第一部分 流式细胞仪（FCM)）工作原理 FCM系统结构 流体系统：样本流、鞘液 光学系统：激光光源、分光镜、滤片、 散射光和荧光探测器 分选系统：压电晶体、液流成滴、加电 系统、偏转系统 数据处理系统：计算机工作站 FCM工作原理流程： 样本（血液实体组织） 单细胞悬液 荧光染料特异染色的样本 上机 细胞单列通过测量区 1.散射光信号 2.荧光信号 分离、收集、分析、光信号 细胞理化特性分析图 加入荧光染料 激光激发 流式细胞仪的构造及原理 FCM测量光信号获取与分析 散射光信号 ●前向散射光(FSC)----细胞大小 ●侧向散射光（SSC)---细胞粒度 （膜的粒度、核大小与粒度、胞质数量） FSC信号越大，表明细胞体积越大；反之，则越小。 SSC信号越大，表明细胞粒度越大；反之，则越小。 根据FSC-SSC二维点图，可以容易区分Lym(R3)Gran(R1)与Mono(R2) R1 R2 Incident Light Source Right Angle Light Dectector a Cell Complexity Forward Light Detector a Cell Surface Area R3 R2 R1 根据FSC-SSC二维点图，可以容易的区分出Lym(R3) .Gran(R1)与Mono(R2) 流式细胞术常用染料及检测波长 荧光染料的发射不同波长 DNA 和RNA荧光探针的理化特性 荧光探针 分子量 结合方式 碱基特异性