xct缺陷的sut黑色素细胞蛋白质组学分析生物医学工程专业论文.docxVIP

天津医科人学硕十学位论文中文摘要 天津医科人学硕十学位论文 中文摘要 研究目的： 以xCT缺陷的Sut黑色素细胞为研究对象，以野生型Mela黑色素细 胞为对照，应用差异蛋白质组学方法研究Sut细胞蛋白质表达谱的变化，从 蛋白质组水平上寻找与xCT缺陷相关的蛋白质，为研究xCT缺陷引起的细胞生 长抑制的机理提供实验支持。 研究方法： 1．Sut和Mela细胞的培养、收集与总蛋白质的制备 Sut和Mela细胞用含10％胎牛血清，100units／ml双抗的DMEM／F12培养液，于 37C，5％C02细胞培养箱培养，收集对数生长期的细胞，细胞中加入适量裂解液 裂解后以l，7000 r／min高速离,t∑,45min，取上清液即为细胞总蛋白。 2．Sut和Mela细胞总蛋白质的二维凝胶电泳及差异蛋白质的串联质谱分析 以Bradford方法测定Sut和Mela细胞的总蛋白浓度，对两组样品分别进行 二维凝胶电泳，应用PDQuest软件分析两组样品的二维凝胶电泳图谱，挑选出 Sut细胞中表达量明显变化的蛋白质点，对这些蛋白质点进行串联质谱分析。 3．数据库查询鉴定差异蛋白质 将串联质谱分析得到的数据输入Mascot软件，在SWISS—PROT数据库中搜 索，鉴定出差异蛋白质。 4．RT-PCR方法检测Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100一A4的mRNA 水平 提取Sut和Mela细胞的总RNA，反转录获得细胞cDNA，通过PCR扩增 Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100一A4的基因，扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳。凝胶扫描，保存图像，通过绘制柱状图对比Sut细胞与Mela细胞mRNA 表达量差异水平。 研究结果： 1．Sut细胞表达差异蛋白质的鉴定 比较Sut和Mela细胞总蛋白质的二维凝胶电泳图谱，发现Sut细胞有20个 蛋白质表达量发生明显变化，其中10个蛋白质表达量明显上调，另Pbl0个明 天津医科大学硕十学位论文显下调。对这20个蛋白质点进行串联质谱分析，将质谱分析得到的数据在 天津医科大学硕十学位论文 显下调。对这20个蛋白质点进行串联质谱分析，将质谱分析得到的数据在 SWISS．PROT数据库中搜索查询，鉴定出这些蛋白质。表达量上调的10个蛋 白质分别为：波形纤维蛋白(Vimentin)，肌动蛋白alpha．1b(Tubulin alpha-lb)， 肌动蛋白beta-5(Tubulin beta．5)，钙依赖磷脂结合蛋白A3(Annexin A3)，钙调 素(Calmodulin)，钙结合蛋白S100一A4(protein S100．A4)，分子量为11kDa的未 知蛋白质，钙结合蛋I兰tSl00．A6(protein S100一A6)，核苷二磷酸激酶B(Nucleoside diphosphate kinase B，NME2)，甲酰谷胱甘肽(S—formylglutathione)；表达量下调的 10个蛋白质分别为：钙腔蛋白(Calumenin)，N．Myc下游调控基因1(N．Myc downstream regulated genelNDRGl)蛋白，鸟氨酸氨基转移酶(Omithine aminotransferase)，二硫键异构酶A3(protein disulfide isomerase A3，PDIA3)，二氢 嘧啶酶相关蛋白2(Dihydropyrimidinase-related protein2，DPYSL2)，ATP合成酶 ATP5A1(ATP5A1)，H2B组蛋白(Histone H2B type 1．K，HISTLH2BK)，分子 量为14kDa的未知蛋白质，基因序列号为OTTMUSG00000007855的未知蛋白质 和分子量为47kDa的未知蛋白质。 2．RT-PCR方法检测Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100一A4的mRNA 水平 通过RT-PCR方法验证Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S1 00一A4的mRNA 水平。实验结果显示，和Mela细胞相比，Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和 S100一A4的mRNA表达水平在Sut细胞中明显上调。 研究结论： 1．与Mela细胞相比，Sut细胞中有20个蛋白质点的表达量存在明显变化， 其中1 O个蛋白质表达量上调，1 0个蛋白质表达量下调。有3个上调蛋白质为 细胞结构相关蛋白(Vimentin，Tubulin alpha．1b，Tubulin beta-5)，3个上调蛋白质 为钙结合蛋白(Calmodulin，protein S100A．4，protein S100A．6)，2个上调蛋白质