不同真菌来源的atp柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达微生物学专业论文.docxVIP

不同真菌来源的ATP-柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达摘要 不同真菌来源的ATP-柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达 摘要 ATP．柠檬酸裂解酶(ATP—citratelyase，ACL，EC2．3．3．8)是脂肪酸合成途径外的 一个关键酶，它能催化柠檬酸裂解成草酰乙酸和乙酰辅酶A。ACL的存在是微生物 油脂积累的_个先决条件，本研究利用基因组步移法和常规PCR法从5种不同的真 菌：粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、斯达酵母(Lipomyces starkeyi)、高山被孢霉 (Mortieralla atpme)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum) 中分别克隆得到了acl基因，并分别在大肠杆菌和毕赤酵母中进行了异源表达，然 后通过紫外分光光度计法测定酶活和气相色谱分析测定脂肪酸含量的方法来对表达 产物进行功能验证。主要结果如下： (1)成功克隆得到了5种真菌来源的acl基因，其中利用基因组步移法克隆得 到了在GenBank中未登录的粘红酵母和斯达酵母的acl基因编码序列，且这两种菌 的acl基因序列完全一致，包含有两个亚基aclJ(1953 bp)和acl2(1494 bp)。 (2)成功将5种真菌来源的乜cf基因在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)进行了诱导 表达，SDS．PAGE检测表明粘红酵母、斯达酵母、米曲霉和核盘菌的来源的acl基 因表达后的ACLl和ACL2亚基的分子量大小都相似，分别约为66 kDa和55 kDa， 高山被孢霉来源的acl基因表达后的ACL蛋白分子量大小约为120 kDa。 (3)对所有大肠杆菌表达后的ACL蛋白酶活力进行了测定，结果表明粘红酵 母、斯达酵母的acl基因表达后具有最高的酶活力(4．2 U／mg)，且只有当ACLl和 ACL2亚基都具备，摩尔比为l：l时才能使全酶的酶活力达到最大。 (4)将粘红酵母acll和acl2基因在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中进行共表达， 气相色谱分析脂肪酸含量，结果表明重组菌株在诱导表达12 h时脂肪酸含量达到最 大，为8．2％，较对照菌株的提高量也达到最大的24．8％，提高效果十分显著。 (5)对粘红酵母acll和acl2基因在毕赤酵母GSll5进行表达研究，结果表明 表达后全酶的酶活力为6．5 U／mg，较原核表达的酶活力提高了近55％，并确定了酶 催化反应的最佳条件为：pH8．5，37℃反应10min。 本研究表明粘红酵母和斯达酵母等油脂酵母类的acl基因可以利用基因工程手 段对其表达量进行调控，提高ACL酶活力，增强脂肪酸的合成。因此，油脂酵母可 提供新的acl基因资源，并应用于后续的转基因植物，提高油料作物的油脂含量。 关键词：ATP．柠檬酸裂解酶；克隆；表达；脂肪酸含量；酶比活 华中农业大学2011届硕士研究生学位论文Abstract 华中农业大学2011届硕士研究生学位论文 Abstract ATP．citrate lyase is considered to be an essential cytoplasmic enzyme of the carbon dioxide—fLxing reductive tricarboxylic acid(RTCA)cycle，since it catalyzes the formation of oxaloacetate and acetyl．CoA from the cleavage of citrate．A survey of a wide Variet)r of oil．producing microorganisms has found a co．elation between those that accumulate high levels of lipids and the presence of ACL activity．In this study,The ATP—Citrate Lyase genes were obtained by GenomeWalker DNA walking and conventional PCR from Rhodotorula glutinis，Lipomyces starkeyi，Mortieralla alpine，Aspergillus oryzae and sclerotinia sclerotiorum、and then were expressed in Escherichia coli and Pichia pastoris． The function of these products were verified by measur