trim28在肿瘤中的表达分析及其与肿瘤相关性机制研究病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

四川医科大学硕士研究生毕业论文目 四川医科大学硕士研究生毕业论文 目 录 TRIM28在肿瘤中的表达分析及其与肿瘤相关性机制研究 1．1 中文摘要 1 1．2 英文摘要 4 1．3 前言 7 1．4 材料与方法 11 1．5 结果 30 1．6 讨{仑 43 1．7 结论 47 1．8 参考文献 48 1．9 英汉缩略词对照表 小 ·’ ．．．． ··52 2 致谢 53 3 TRIM28生理机能调节作用及其与肿瘤发生与转移的相关性 研究进展(综述) 55 万方数据 四川医科大学硕士研究生毕业论文TRIM28在肿瘤中的表达分析及其与肿瘤相关性机制研究 四川医科大学硕士研究生毕业论文 TRIM28在肿瘤中的表达分析及其与肿瘤相关性机制研究 摘 要 目的：①构建pcDNA5一TRIM28重组质粒，建立可诱导稳定表达 pcDNA5一TRIM28一HEK293细胞系。②探讨TRIM28基因在分子水平的调 控作用及其在肿瘤中的表达。③TraM28与肿瘤相关性及机制分析。方法： 首先，经PCR技术、酶切消化、测序验证和免疫印迹杂交技术，成功构建 pcDNA5一TRIM28重组质粒和可诱导稳定表达TRIM28一HEK293细胞系。 其次，提取TRIM28一HEK293细胞系蛋白质，同时设立对照，通过双向电 泳，质谱鉴定，鉴定出TRIM28调节的靶基因，并设计靶基因引物。选取 DOX最佳诱导时间(12h)和最佳诱导剂量(0．199／m1)诱导可稳定表达 TRIM28一HEK293细胞系，提取RNA，在逆转酶的作用下反转录成cDNA， 以逆转录产物为模板，由1 1对基因的特异性扩增引物进行荧光定量PCR 扩增，验证双向电泳的结果。同时在HeLa细胞系中过表达TRIM28，转染 24h后提取RNA，在逆转酶的作用下反转录成cDNA，以逆转录产物为模 板，由1 1对基因的特异性扩增引物进行荧光定量PCR扩增，进一步验证 双向电泳的结果。再次，提取7种不同肿瘤细胞系RNA，反转录成cDNA， 以逆转录产物为模板，由TRIM28和内参(18S RNA)的特异性扩增引物 进行荧光定量PCR扩增，通过荧光定量PCR检测TRIM28在不同肿瘤细 胞系中mRNA的表达水平。同时本实验收集了l 1例癌旁正常乳腺组织标 本和33例乳腺肿瘤组织标本，提取RNA，在逆转酶的作用下反转录成 cDNA，以cDNA为模板，由TRIM28和内参(18S RNA)的特异性扩增 引物进行荧光定量PCR扩增，通过荧光定量PCR检测TRIM28在癌旁正 常组织和肿瘤组织中mRNA表达水平的差异。在4T1细胞系或者HeLa细 胞系中过表达TRIM28，分别提取RNA及蛋白质，通过荧光定量PCR技 术及Western blot技术检测TRlM28、TWISTl与肿瘤的相关性及机制。结 万方数据 四川I医科大学硕士研究生毕业论文果：成功构建pcDNA5一TRIM28重组质粒和可诱导稳定表达TRIM28一 四川I医科大学硕士研究生毕业论文 果：成功构建pcDNA5一TRIM28重组质粒和可诱导稳定表达TRIM28一 HEK293细胞系。将pcDNA5一TRIM28重组质粒和pOG44质粒共转染入 HEK一293细胞系中，用潮霉素B筛选阳性克隆。经Western blot技术检测 发现，在转染了空载体的对照组Flp—InTMT．RExTM-293细胞系中，无论加 DOX诱导还是未加DOX诱导，都不会检测到TRIM28的表达。而在共转 染了pcDNA5一TRIM28重组质粒和pOG44质粒的Flp—InTMT—RExTM一293 细胞系中，未加DOX诱导的一组同样检测不到TRIM28的表达，而在加 入适量DOX诱导的实验组中，TRIM28明显有较高水平的表达。通过分析 结果可以进一步证明可诱导稳定表达TRIM28一HEK293细胞系构建成功。 提取可诱导稳定表达TRIM28一HEK293细胞系蛋白质，进行双向电泳和质 谱鉴定，结果发现1 1个受TRIM28调节的蛋白质基因，其中上调基因有3 个、下调基因有8个。根据双向电泳中检测出的TRIM28调节的1 1个靶基 因设计引物，DOX诱导稳定表达TRIM28一HEK293细胞系，提取RNA， 反转录后进行荧光定量PCR检测；并在HeLa细胞系中过表达TRIM28， 同样进行荧光定量PCR检测，分析结果发现部分验证了双向电泳的结果， TRIM28具有调控的作用，可上调或下调某些基因的表达。提取7种不同 肿瘤细胞系RNA，经反转录和荧光定量PCR检测发现，在MDA—MB一23 1 细胞系、T47D细胞系、MCF．7细胞系、MDA—MB一435细胞系及HEK293 细胞系中，TRIM28 mRNA的表达水平都显著升高，这表明TRIM28 mRNA 的