鼻咽癌双特异性抗独特型抗体疫苗的生物学活性鉴定及免疫机制研究病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名：一．量里!里 Et其I．』型L年』』日 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：—兰比 导师签名缚日期：型年』月五日 -iA‘ 中南大学博士学位论文 中南大学博士学位论文 中文摘要 摘要 第一章鼻咽癌人源双特异性抗独特型抗体疫苗的制备 及活性鉴定 目的：构建能够表达全人源鼻咽癌双特异性抗独特型抗体的原核表 达载体pET25b—G22一150及单价抗独特型抗体的原核表达载体 pET25b．G22、pET25b．150，并对其表达产物作初步鉴定。 方法：利用分子克隆技术依次或分别将G22、150插入到原核表达载 体pET25b(+)中，转化入E．coli DH5ct，经菌落PCR、双酶切验证并 测序。将阳性重组子转化入表达菌株E．coli BLZl(DE3)，经IPTG诱 导表达后，表达的重组蛋白经His．tag纯化试剂盒纯化后复性。用 Western blot方法鉴定抗独特型抗体G22．150、G22、150的表达，ELISA 方法分析其蛋白活性。 结果：构建的原核表达载体pET25b．G22．150、pET25b．G22、 pET25b．150经测序验证，序列正确。三种蛋白G22．150、G22、150 均以包涵体形式高效表达，经纯化后纯度达90％以上。Western blot鉴 定表达的蛋白相对分子质量(№)分别约42 000，27 000，15 000， 与预期相符。ELISA方法鉴定复性后的蛋白均已恢复活性，能够用于 体外实验。 结论：成功获得了有活性的人源双特异性抗独特型抗体G22．150及单 价的抗独特型抗体G22、150，为研究鼻咽癌抗独特型抗体疫苗的主 动免疫机制鉴定了坚实的基础。 第二章 双特异性抗独特型抗体体外抗肿瘤免疫机制研究 目的：比较鼻咽癌双价双特异性抗独特型抗体G22．150与单价的抗独 特型抗体G22、150在体外抗肿瘤免疫情况，并对其可能的机制作初 中南大学博士学位论文步探讨。 中南大学博士学位论文 步探讨。 方法：诱导表达G22。150、G22、150三种蛋白并用Western blot及ELISA 方法进行活性鉴定。常规分离人外周血单个核细胞(PBMC)，分别用 G22．150、G22、150抗独特型抗体刺激并培养，采用MTT法、LDH释 放法分别观察淋巴细胞增殖情况和细胞毒作用，ELISA方法测定用各 抗独特型抗体刺激后培养上清液中IFN-7、IL．2、IL．4水平的变化， 流式细胞术检测刺激后淋巴细胞表型的改变。 结果：与G22、150组相比，G22．150刺激后的PBMC增殖明显，且 对鼻咽癌细胞HNE2有特异的杀伤作用。G22．150刺激后的PBMC培 养上清液中IFN-，l,、IL一2水平均比G22、150组有所增加，而对IL．4 水平没有明显影响。流式细胞术显示刺激后的PBMC中CD4+,CD8+T 细胞比例增加，CD4／CD8的比率增加，而CD4+CD25+Treg细胞的比 例有所减少，其中以G22．150组最为明显。 结论：G22．150具有更强的免疫原性并能增强PBMC的特异性杀瘤作 用，其机制可能与促进PBMC的增殖，诱导具有抗肿瘤作用的Thl 细胞因子的分泌并活化CD8+T细胞，抑制CD4+CD25+Treg细胞的表 达有关。 第三章双特异性抗独特型抗体体内抗肿瘤免疫机制研究 目的：分别利用Balb／c小鼠和hu．PBL．SCID小鼠模型研究双特异性 抗体疫苗的抗肿瘤效应，并对其可能的机制作深入探讨。 方法：将双特异性抗独特型抗体疫苗G22—150及单价的抗独特型抗体 疫苗G22、150分别免疫Ba