人类载脂蛋白aⅴ与血脂和炎症因子的关系以及tnfα下调其表达的机制初探内科学心血管专业论文.docxVIP

博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 人类载脂蛋白AV与血脂和炎症因子的关系以及TNF-Q下调 其表达的机制初探 摘要 背景 冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease，CHD)是导 致人类死亡和病残的主要疾病之一，血循环中甘油三酯(triglyceride， TG)水平的升高是其发病的独立危险因素。载脂蛋白(apolipoprotein) 是调节血脂代谢的最重要因素，尤其是Apo A I／CⅢ／AⅣ基因簇与血 脂代谢联系非常紧密。通过比较人类和小鼠的该基因簇序列，人们发 现了一种新的载脂蛋白——载脂蛋白AV(apolipoprotein AV，Aim AV)。目前许多研究表明，Apo AV是调节血循环中TG水平的最重 要因素并且还可能影响高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol，I-IDL-C)的代谢，但这些研究多是以动物为实 验对象而且得出的结论互不一致，因此应该在人类自身：i艄-y Apo A．V一 的功能研究如与血脂的关系等。 机体炎症通常伴有高甘油三酯血症，这与炎症细胞因子 (inflammatory cytokine)有关·炎症细胞因子如肿瘤坏死因子Q (tumor necrosis factor-Q，TNFw a)能刺激和调节炎症反应，而且与 极低密度脂蛋白胆固醇(very low density lipoprotein，VLDL)中的胆 固醇及甘油三酯呈正相关而与HDL-C负相关，其具体机制尚不清楚。 炎症因子是否可影响Apo AV的表达从而升高血TG水平则有待进一 步研究。 博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 目的 应用基因工程技术，用质粒作为人类Apo AV基因载体，转化并 构建大肠杆菌原核表达系统表达重组人类Apo AV蛋白并进一步将 之纯化。免疫小鼠产生抗人类Apo AV的单克隆抗体，建立检测人类 Apo AV的双抗体三明治夹心ELISA方法，进而观察健康中国人群中 血清Apo AV与血脂、炎症因子高敏C反应蛋白(high sensitive C reaction protein，Hs．CRP)及TNFQ的关系。应用TNF—Q刺激HepG2 细胞株构建体外炎症反应细胞模型，探讨炎症反应对HepG2细胞Apo AV基因表达、蛋白合成的影响，并进一步探讨其机制是否与核转录 因子-r,B(nuclear transcription factor-kappa B，NF-r．B)活化有关· 方法 1．将人类Apo AV cDNA及载体质粒用限制性核酸内切酶切割再 酶连以建立重组质粒，转化表达宿主大肠杆菌并以IPTG诱导重组蛋 白表达，超声裂菌提取目的蛋白，Ni．NTA亲和层析法纯化，逐步透 析法复性。 2．将重组人类Apo AV免疫Balb／c小鼠，提取免疫脾细胞，应用 杂交瘤技术与SP2加骨髓瘤细胞融合，用HAT及HT进行选择培养， 有限稀释法筛选阳性克隆以建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，注 入小鼠腹腔制备腹水，亲和层析法纯化单抗，过碘酸钠法标记单克隆 抗体，方阵法确定三明治双抗体夹心ELISA法的最佳实验条件· 3．血清甘油三酯、总胆固醇浓度用酶法测定，HDL-C、LDL-C浓 度采用化学遮蔽法直接测定；Hs．CRP用免疫透射比浊法测定；耵眼Q n 博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 用ELISA方法测定；应用针对不同抗原位点的抗重组Aim AV单克 隆抗体配对，形成夹心三明治ELISA方法以检测人血清Aim AV· 4．体外培养HepG2细胞株，将培养的细胞分别以不同浓度的 TNFm Q分别作用或用相同浓度的TNFm Q分别作用不同时间，或将 NF-r,B抑制剂吡咯烷二硫代氨甲基甲酸盐(Pytrolidine dithiocarbanate， PDTC 50／比mol／L)与TNFm a同时作用，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 检测Apo AVmRNA表达，ELISA法检测NF-r．B的活化，ELISA法 检测细胞培养上清液中Apo AV含量。 结果 人类Apo AV eDNA插入pQE30质粒建立了重组质粒，转化到宿 主菌诱导表达了目的蛋白，产物蛋白经亲和层