slit2对tnfα介导的内皮细胞炎症介表达的影响及其机制的探讨内科学专业论文.docxVIP

组)：培养基中分别含1099／L的TNF．0t和不同浓度梯度的Slit2蛋8(25、 组)：培养基中分别含1099／L的TNF．0t和不同浓度梯度的Slit2蛋8(25、 50、100、20099／L)，各组细胞培养24h后用real．time PCR和Eliasa技术检 测IL．8基因及蛋白的表达。2．人脐静脉内皮细胞分为正常对照组(NC 组)：培养基中不含TNF．Q和Slit2；阳性对照组(TNF．0t组)：培养基中 TNF．0【的终浓度为1099／L；实验组(TNF．a+Slit2组)：培养基中含有1099／L 的TNF．0【和10099／L的Slit2，分别将各组细胞培养24h后，采用real-time PCR及Western Blot方法检测ICAM．1、VCAM．1基因及蛋白的表达。 结果：1．与NC组比较，1099／L的TNF．0【可上调人脐静脉内皮细胞IL一8 mRNA的表达，并促进IL．8的分泌(P0．01)。2．Slit2蛋白的浓度为5099／L、 10099／L、20099／L时可以抑制TNF．Q介导的人脐静脉内皮细胞IL-8的基 因及蛋白的表达(P0．05)，并且Slit2蛋白的浓度为1 0099／L时抑制作用 更明显(P0．01)。3．100pg／L Slit2可抑制TNF．0t介导的人脐静脉内皮细 胞VCAM．1、ICAM．1基因及蛋白的表达(P0．01)。 结论：1．Slit2可以抑制TNF．仅介导的内皮细胞炎症介质IL．8的分泌；2．Slit2 对TNF．0c引起的内皮细胞粘附分子ICAM．1、VCAM．1的上调具有抑制作 用。 第三部分：Slit2蛋白及其受体Robo抑制TNF．O【介导的人脐静脉内皮细胞 炎症反应的机制探讨 目的：1．探讨Slit2蛋白在抑制人脐静脉内皮细胞炎症反应中的受体是 Robol或Rob04 2．初步探讨Slit2蛋白抑制人脐静脉内皮细胞炎症反应的可 能机制。方法：1．利用siRNA技术沉默内皮细胞Robol或Rob04蛋白的表 达。针对Robol、Rob04基因序列的三个不同位点，设计三段不同的siRNA 序列，分别命名为Rob01．siRNA．1、Rob01．siRNA．2、Robol—siRNA．3， 万方数据 Rob04．siRNA．1、Rob04．siRNA．2、Rob04．siRNA．3。细胞分为以下三组： Rob04．siRNA．1、Rob04．siRNA．2、Rob04．siRNA．3。细胞分为以下三组： 正常对照组(NC组)；阴性对照组(NT-s垠NA组)；实验组：细胞分别转 染Rob01．siRNA和Rob04．siRNA。将各组细胞培养48小时后，利用real．time 及Western Blot检测Robol、Rob04基因和蛋白的表达，筛选最佳转染位点。 2．转染后的细胞分为以下三组：(1)转染NT-siRNA组：①阴性对照组： 培养基中不含TNF．a和Slit2；②TNF．Q组：培养基中含lOlxg／L的TNF．0【； ③TNF-a+Slit2组：培养基中含10I-tg／L的TNF．0【和100}tg／L的Slit2；(2) 转染Rob01．siRNA组：培养基中含lOlxg／L的TNF．a和1001xg／L的Slit2； (3)转染Rob04-siRNA：培养基中含lOlxg／L的TNF．a和100I．tg／L的Slit2。 分别将各组细胞培养24小时后，用real．time PCR及Western Blot检测各组 细胞细胞炎症介质ICAM．1及VCAM．1的表达，3．将细胞分为正常对照组： 培养基中不含TNF-0【和Slit2；阳性对照组(TNF-0t组)：培养基中含lOlxg／L 的TNF—Or；实验坌R(TNF—a+Slit2组)：培养基中含l OI-tg／L的TNF．0【和l 00Itg／L 的Slit2，分别在加入Slit2蛋白后的1h、2h、4h提取各组细胞蛋白，利用 Western Blot检测各组细胞各时间点IKBa、p-IKBa、NF-kB、p-NF-kB的表 达变化。 结果：1．人脐静脉内皮细胞转染Rob01．siRNA．1或Rob04．siRNA．1后分别 可以沉默Robol或Rob04蛋白的表达。2．TNF．a+Slit2+NT-siRNA组与 TNF计NT-siIⅢA组比较，Slit2可以抑制ICAM．1、VCAM．1基因及蛋白的 表达(P0．05)。3．TNF．a+NT-siRNA组与转染Robol组比较ICAM．1、 VCAM．1基因及蛋白的表达降低(P0．05)，与转染Rob04组比较，ICAM．1 及VCAM．1基因及蛋白的表达无统计学差异(P0．05)。4．转染Robol组 与转染Rob