肠炎沙门氏菌sef14菌毛功能探索预防兽医学专业论文.docxVIP

n n 扬州大学博上学位论文 1 SEFl4菌毛操纵子在肠炎沙门氏菌和相近D一群沙门氏菌中的变异 本试验部分用PCR方法检测了18株鸡白痢沙门氏菌，11株肠炎沙门氏菌以 及1株都柏林沙门氏菌株中SEFl4菌毛操纵子亚单位基因sefA，sefD以及调控基 因sefR存在与变异情况。结果表明：从11株肠炎沙门氏菌以及1株都柏林沙门 氏菌染色体DNA中能成功扩增sefA，sefD以及sef8基因；从18株鸡白痢沙门氏 茵能成功扩增sefA基因，但只有分离于1980年之前的7株分离菌能成功扩增sefD 和sefR基因，而另1l株1980年后分离菌PCR扩增却无任何产物。PCR产物测 序结果表明，11株肠炎沙门氏菌以及l株都柏林沙门氏菌株中J相，sefD以及sefR 基因和已发表的序列100％同源；分析比对分离于1980年之前的7株鸡白痢沙门 氏菌sefD基因测序结果，发现在196位点发生碱基缺失，造成阅读框移码，在氨 基酸71位点处产生终止密码子。优化体外菌毛表达的培养条件，体外菌毛抽提和 鉴定试验证明：肠炎沙门氏菌以及都柏林沙门氏菌体外能很好表达SEFl4菌毛， 但鸡白痢沙门氏菌却无任何表达迹象。SEFl4菌毛操纵子结构基因s删，sefD以 及调控基因sefR在不同沙门氏菌中的变异情况可能是SEFl4菌毛在肠炎沙门氏 菌、都柏林沙门氏菌中特异性表达的原因之一。 2肠炎沙门氏菌SEFl 4菌毛主要亚单位sefA的克隆、表达以及免疫活 性检测 据肠炎沙门氏菌SEFl4菌毛操纵子亚单位sefA基因序列设计一对引物，利用 PCR技术从国内标准株50336@扩增sefA基因，并按预定的阅读框插入表达性载体 pET22b+中，获得重组质粒pETsefA，经限制性内切酶酶切消化结合琼脂糖凝胶电 泳分析和序列测定结果表明，该序列大d为498bp，与已发表的sefA结构编码序列 完全一致。重组质粒pETsefA转化大肠杆菌E coli BL21(DE3)并能获得高效诱导表 达，对菌体裂解上清液通过SDS．PAGE和Western-blotting分析鉴定，该重组菌可以 表达大小为15．2kD的可溶性重组蛋白rSEFA。纯化rSEFA免疫小鼠得到的高免血清 与标准株50336感染小鼠血清一样，在Western．blotting@，均能识别标准株肠炎沙 门氏菌SEFl4菌毛蛋白以及纯化的重组蛋白rSEFA，说明体外表达的rSEFA蛋白有 较好的免疫原性和反应原性，为后续建立肠炎沙门氏菌特异性检测方法提供基础。 3肠炎沙门氏菌间接ELISA检测方法的建立 建立和优化了重组蛋白rSEFA介导的间接ELISA方法特异性检测肠炎沙门 朱春红：肠炎沙门氏菌SEFl4菌毛功能探索 朱春红：肠炎沙门氏菌SEFl4菌毛功能探索 In 氏菌血清抗体。确定了其抗原最佳包被量为7．59tg／ml，血清最适稀释度1：100， 作用时间为60min；酶标二抗最适稀释度为l：4000，作用时间为60min：判定标 准为OD值≥0．346，基于rSEFA介导的间接ELISA有较好的特异性，能特异性 识别肠炎沙门氏菌和都柏林沙门氏菌感染血清，不能识别相近的鸡白痢沙门氏菌 感染血清，此方法与菌体凝集反应同时检测临床随机血清样品100份，两者阳性 率分别为67％和54％，结果符合率为80．6％。这一方法的建立对肠炎沙门氏菌特 异性抗体检测有潜在的应用前景，试剂盒的完善将填补国内相关研究的空白，为 家禽种群肠炎沙门氏菌净化工作以及日常血清筛查提供了极大的便利。 4基于Red同源重组和高效自杀性载体系统构建肠炎沙门氏菌SEFl4 菌毛亚单位突变株 Red同源重组系统和高效自杀性载体系统都能对革兰氏阴性菌染色体直接进 行修饰，本试验利用上述两种系统敲除4株不同来源肠炎沙门氏菌(X)SEFl4菌 毛操纵子亚单位sefD或s锄基因，包括国际国内标准株(SD．2，50336)，鸡源以及 人源临床分离株(S．09，SE43)，并对构建肠炎沙门氏菌突变株方法进行比较。基 于含s勰因同源臂片段和抗生素表达盒的PcR扩增产物，利用Red同源重组系统， 电转化PCR扩增产物至不同源肠炎沙门氏菌各菌株，通过同源臂发生同源重组交换 缺失sesZ堪因，一步法构建各菌株sefD基因突变株XAsefD：：Cat(氯霉素抗性基因)。 在二次重组中利用携带FLP位点特异性重组酶的温度敏感性质粒，去除上述突变株 中的筛选用抗性基因标志，获sefD基因突变株XAsefD，结合PCR扩增和序列鉴定， 证明上述各突变株正确构建。在高效自杀性载体系统中，根据sefA基因两端的已知 序列，P