从hsf1水平探讨烧伤后小鼠巨噬细胞炎症反应中的内源性保护作用外科学专业论文.docxVIP

咖I 咖I I I It ll ti l t TII I lllll Y1 9 1 8232 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名： 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅：学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名： 导师签 年』月堂日 博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 摘要 第一章小鼠IL．10及TNF一0【启动子荧光素酶报告质粒的构 建 目的：构建小鼠IL-10及TNF．a野生型及突变型启动子荧光素酶 报告质粒。 方法：分析IL．10及TNF．Q启动子区域，采用PCR技术从小鼠腹腔 巨噬细胞RAW264．7中扩增出启动子，插入荧光素酶报告基因载体 pGL3．basic中成为野生型报告质粒。再以野生型质粒为模板设计引物 定点突变启动子核心区域，突变完成后同样连接于pGL3．basic载体质 粒。酶切及测序鉴定所构建质粒。 结果：经过双酶切后凝胶电泳，IL-10及TNF．Q启动子报告质粒 分别得到约680bp、240bp长度的片段。质粒测序发现野生型报告质 粒序列与Gene Bank比较碱基排列一致，无碱基突变、缺失。突变型 IL-10、TNF．(It启动子核心区域碱基“ttctggaa’、“GAA’’分别被替换 为“tactgccc、“GCC，形成突变型报告质粒。 结论：成功构建小鼠IL．10及TNF．(It野生型和突变型启动子荧光 素酶报告质粒。 博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 第二章NF．1(B p65亚基真核表达质粒的构建 目的：构建小鼠NF．rd3 p65亚基真核表达质粒。 方法：从培养的小鼠腹腔巨噬细胞RAW264．7中提取总RNA， 逆转录得到DNA，利用PCR方法钓取目的基因，将目的基因与目的 载体pcDNA3．1(．)分别进行酶切。酶切产物电泳回收后进行定向连接， 其产物转化细菌感受态。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定，再对 PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的即为构建成功 的目的质粒。 结果：经过RT-PCR得到长度约1660bp的DNA片段。阳性转化 子测序发现DNA序列两处发生同义突变，但不影响其翻译结果，其 余碱基排列无缺失或突变。 结论：通过RT-PCR克隆出小鼠NF．r．B p65亚基基因，并成功连 接于目的载体，为进一步研究NF．r,B在烧伤后免疫反应中的作用机 制打下实验基础。 博目的：观察烧伤血清刺激后小鼠巨噬细胞NF．r,B启动子活性的 博 目的：观察烧伤血清刺激后小鼠巨噬细胞NF．r,B启动子活性的 变化，以及过表达HSFl对NF．r,B可能的调控作用。 方法：制作15％TBSA HIo烧伤小鼠模型，提取烧伤血清。通过 表达质粒与报告质粒共转染，检测烧伤血清诱导下NF．r,B启动子活 性的变化以及过表达HSFl后NF．KB活性的变化规律。 结果：对比正常血清，烧伤血清刺激后NF．r,B启动子相对荧光 素酶活性早期即明显增加(Po．05)，这种变化在诱导后2小时即达 到高峰，12小时后逐渐下降；过表达HSFl可以显著抑制烧伤血清引 起的这种变化(PO．05)。 结论：NF．r,B是一个受HSFl调控的转录因子，在烧伤后早期活 化，HSFl过表达可以直接抑制NF．1cB的启动活性。 博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 第四章烧伤血清诱导下HSFI与NF．KB相互作用对TNF．0【、 也．10和HMGBI启动活性的影响 目的：观察在烧伤血清诱导下，HSFI与NF．r．B相互作用对早晚 期炎症介质的调控作用，综合前期研究成果从HSFI水平探讨烧伤后 重要炎症因子的表达调控及可能的机制。 方法：以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264．7为研究对象，采用脂质体 瞬时共转染HSFI与NF．r,B p65亚基表达质粒及炎症因子n吓．扒 IL-lO、HMGBI启