β甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质研究微生物学专业论文.docxVIP

IIi IIi lilJI I I I iiliM illiil[1lilliilllllil Y2223295 摘要 类芽孢杆菌CH一3(Paenibacillus sp．CH-3)是本实验室从刺槐种子中筛选分离到的一 株植物内生菌，具有较强的∥．甘露聚糖酶活性，采用简并PCR和TAIL．PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)技术从该菌基因组DNA中克隆得到∥．甘露聚糖酶基因 (manA)。序列分析表明，该基因开放阅读框(ORF)为984bp，编码一个含有327个氨基 酸、等电点为7．01、理论分子量约为35．270KDa的蛋白，N端前32个氨基酸为其信号肽。 同源性分析显示，该酶氨基酸序列与来源于Paenibacillus sp．A1 MANAl的氨基酸序列同 源性高达81．35％，属于糖苷水解酶5家族(GH5)的一员。通过对该酶分子三维结构的预 测分析，该酶的二级结构由14个a螺旋和15个居折叠股构成，其催化域采用一定的折叠方 式形成TIM桶状结构。 根据表达载体pET32a(+)或pET28a(+)的多克隆位点及目的基因序列特点，选择 BamH 1和Sal 1酶切位点处作为目的基因的插入位置，构建重组表达质粒pET．manA， 并将其转入大肠杆菌表达系统BL21(DE3)，经过诱导获得了此酶的高效表达。对重组／3． 甘露聚糖酶酶活力进行初步检测，结果显示，酶活力可达90．34 U／ml。表达产物经 SDS—PAGE凝胶电泳分析，蛋白图谱显示1条大约为50．4KDa(pET28a表达系为 39．4I①a)的特异性条带。 实验探讨了温度、诱导物(IPTG)浓度和诱导时间三种单因素对重组．∥．甘露聚糖 酶基因工程菌产酶的影响，并在此基础上设计了正交组合试验，结果显示，该菌摇瓶发 酵的最佳条件组合为：发酵温度28℃，IPTG O．05 mM，诱导时间12 h，且在此发酵条 件下，酶活力可达1 054．17 U／mL，比初始酶活提高了约10．7倍。各因素对该菌产酶的 影响大小依次为诱导物(IPTG)浓度诱导时间互作项(温度×IPTG浓度)温度。 50 L发酵罐中进行该菌扩大培养试验，结果表明，在添加诱导物(IPTG)2 h后，届．甘 露聚糖酶的活力就己达到较高水平，诱导8 h后，酶活力达到最高，为1 917．96 U／ml， 比初始酶活力提高了约20．2倍。之后酶活力略有下降，但总体上来看保持稳定。 酶学性质研究表明，该菌所产的重组∥．甘露聚糖酶最适作用温度和pH分别为45 ℃和7．0。该酶在35．45℃范围内酶活力比较稳定，50℃条件下保温30min后，酶活仍 保留74．23％，55℃保温30min后酶活基本丧失；pH 4．0．7．0条件下保温15 min酶活均 保留87．06％以上；Ca2+、Ba2+、M92+、Mn2+、C02+对该酶具有激活作用，其中以Ca2+ 保留87．06％以上；Ca2+、Ba2+、M92+、Mn2+、C02+对该酶具有激活作用，其中以Ca2+ 的激活作用最为明显，可使酶活力提高约61％；Cu2+、 Zn2+、 EDTA和Fe2+对其具有 抑制作用。 枯草芽孢杆菌HD一1(Bacillus subtilis HD-1)是本实验室从黄豆种子中筛选分离到的 另一株植物内生菌，同样具有较强的∥．甘露聚糖酶活性，利用PCR技术从该菌基因组 DNA中克隆得到∥．甘露聚糖酶基因(manB)，序列分析表明，该基因全长1089bp，N端 前27个氨基酸为其信号肽。该酶氨基酸序列与相同来源的届．甘露糖苷酶同源性最高达 98．34％，具有ManB保守结构域，属于糖苷水解酶家族26的一员。通过对该酶分子三 维结构的预测分析，该酶的催化域形成TIM桶状结构，Cys 92和Cys 112形成二硫键， 它们之间的部分构成该酶的氧化还原反应的活性中心。三维结构的分析为提高酶的催化 活性和功能方面的定向改造提供了依据。 关键词：内生，Paenibacillus sp．CH一3，夕-甘露聚糖酶，基因工程菌，酶学性质，Bacillus subtilis HD—l II ABSTRAC ABSTRAC T Paenibacillus sp．CH一3 which had a high levelfl-mannanase activity was endophyte strain isolated from locust seed in 0111laboratory,the岱-marmanase encoding gene(manA)was isolated from it by degenerate PCR and TAIL-PCR．Sequence analys