微生物试验技术03菌种保藏.docVIP

菌种保藏 一、 目的要求 学习与比鮫几种菌种保藏的方法。 二、 基本原理 微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程屮，必须使微生物的代谢处于最 不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发住变异而乂保持牛活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微纶物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方 法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。 保藏方法大致可分为以下几种： 1、 传代培养保藏法 乂有斜而培养、穿刺培养、庖肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后 于4?6°C冰箱内保存。 2、 液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在 斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面町防止因培养基水分蒸发 而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3、 载体保藏法 是将微牛物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的 保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4、 寄主保藏法用于上前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏 体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般 微住物的传代培养保藏法。病毒等微住物亦可用其他方法（如液氮保藏法与冷冻T燥 保藏法）进行保藏。 5、 冷冻保藏法 可分低温冰箱（一20?一30°C, — 50?一80°C）、干冰酒精快速冻结（约一70°C ） 和液氮（一 196°C）等保藏法。 6、 冷冻T?燥保藏法 先使微牛物在极低温度（一7（TC左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象 除去水分（真空干燥）。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备 细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质口J通过氢和离了 键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂侑牛乳、血清、糖类、 甘汕、二甲亚矶等。 三、 器材 细菌、酵母菌、放线菌和得菌； 肉膏蛋白丿冻斜面培养棊，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，y油，五 氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐、干冰，95%酒精，10%盐酸，无水氯化 钙。 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安韻管，泪滴形安瓶管(长颈球形底)， 4()冃与此同时10()冃筛子，油纸，滤纸条(0.5X 1.2cm) 燥器，真空泵,真空压力表， 喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱(一30°0,液氮冷冻保藏器。 四、 操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1、 斜而低温保藏法将菌种接种在适宜的固体斜而增减基上，待菌充分牛长后， 棉塞部分用油纸包扎好，移至2?X°C的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而冇不同，霉菌、放线菌及冇芽泡的细胞保存2?4个刀， 移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特 殊设备，能随时检査所保藏的菌株是否死亡、变界与污染朵菌等。缺点是容易变界因 为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影 响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。 2、 液体石蜡保藏法 将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎,1.05kg/cm2, 121.3°C 灭菌30分钟，然后放在于40°C温箱中使水汽蒸发掉，备用。 将需耍保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或紀子。 用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其川量以高出斜面顶 端lcm为准，使菌种与空气隔绝。 将试管直立，置低温或室温下保存(有的微住物在室温下比冰箱中保存的时间还 要长)。 此法实用而效果好。得菌、放线菌、芽施细菌町保藏2年以上不死，酵付菌可保 藏1?2年，一般无芽他细菌也可保藏1年左右，甚至川一般方法很难保藏的脑膜炎球 菌，在37°C温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备， 且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较人，同时也不便携带。从 液体石蜡下而取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石 蜡一起飞溅，应特别注意。 3、 滤纸保藏法 （1） 将滤纸剪成0.5 X 1.2cm的小条，装入0.6X8cm的安甑管中，每管卜2张，塞 以棉塞，1.05炬血『，121.3C灭菌30分钟。 （2） 将需要保存的菌种，在适宜的斜而培养基上培养，使充分生长。 （3） 取灭菌脱脂牛乳1?2ml滴加在灭菌培养I1IL或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀, 制成浓悬液。 （4） 用火菌铁子白安甑管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱再放I川至安甑管中，塞 上棉塞。 （5） 将安瓶管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至T。 （6） 将棉花