耳草属岭南药材DNA分子鉴定研究-世界科学技术——中医药现代化.PDF

世界科学技术—中医药现代化★中药材DNA条形码鉴定研究 耳草属岭南药材 DNA 分子鉴定研究＊ 1 2 1 1 2 ＊＊ 1 ＊＊ 黄 娟 ，李西文 ，徐 文 ，丘小惠 ，徐 江 ，黄志海 （1. 广东省中医院第二临床医学院 广州 510006；2. 中国中医科学院中药研究所 北京 100700） 摘 要：目的：本研究应用ITS2 序列作为DNA 条形码对9 种广东耳草属药材进行鉴定研究。方法：收 集广东耳草属药材样本，通过植物基因组DNA 提取、PCR 扩增以及产物的双向测序获得ITS2 序列，所得 序列采用CodonCode Aligner 进行拼接。用MEGA 6.06 进行比对，分析种内和种间遗传距离，并构建系统 进化树。结果：9 种耳草属植物65 条序列长度范围为208-224 bp ，共有92 个碱基变异位点，种内遗传距离 （0.002 ）明显小于种间遗传距离（0.202 ）。NJ 和ML 聚类树结果基本一致，除耳草与金毛耳草关系较近难 以区分外，其余7 个物种种内样本分别聚在一支，表现出单系性。结论：ITS2 序列基本能够准确的鉴定广 东耳草属药材，可作为耳草属药材基原植物鉴定的候选条形码序列。 关键词 ：耳草属 ITS2 序列 分子鉴定 DNA 条形码 doi ：10.11842/wst.2016.08.026　　中图分类号：R282　　文献标识码：A 耳草属Hedyotis 隶属于茜草科Rubioideae ，主要 保临床用药的安全有效。 分布于热带和亚热带地区，少数分布至温带。《中国 DNA 条形码技术是近年来生物分类及鉴定的 [6] [7] 植物志》记载耳草属植物主要分布于长江以南各省 研究热点 。2010 年，Chen 等 发现ITS2 序列在 区，其中以广东省居多[1] 。耳草属植物在岭南民间 物种水平的鉴定效率高达92.7% ，适用于中药材等 多作为中草药来防病治病。据统计，在广东地区药 存在DNA 降解的材料，并提出把ITS2 作为药用植 用耳草属植物约有20 种[2] ，其中白花蛇舌草、伞房 物鉴定的标准条形码序列，现该技术已得到广泛应 花耳草、金草、牛白藤、双花耳草、长节耳草、金毛耳 用。该序列在种属水平的变异度较大，适用于物种 草等分布较广，使用较多[2-4] 。近年来，已有多种耳 分类与系统的进化、药材真伪鉴别、药材基原探索 草属药材开发成制剂，其中，白花蛇舌草注射液已 等研究[8-10] 。因此，本文将选用9 种耳草属常用药材， 推广到国内多个厂家生产[5] ，金毛耳草是肠炎宁制 采用ITS2 序列作为DNA 条形码对其进行鉴定，为 [1] 剂的主药 。 耳草属药材的物种准确及快速鉴定提供分子依据。 由于中药材市场的混乱以及民间使用习惯、一 1 材料和方法 药多名、异药同名等原因，造成中药材品种混乱。同 . 材料 时因药材形态特征有限，尤其是同属药材，难以从外 1 1 观上准确快速鉴定，造成严重的混伪品误用现象。如： 实验采集白花蛇舌草、牛白藤、耳草、鼎湖耳草 市售白花蛇舌草伪品主要来源于伞房花耳草及纤花 及伞房花耳草等5 个物种共51 份样本（图 1），材料 耳草，个别地区甚至把伞房花耳草直接作为白花蛇 经广东省中医院黄志海主任药师鉴定，凭证标本保 舌草来使用[4 ，5] 。因此正确鉴定同属植物有利于确 存于广东省中医院。此外，从GenBank 数据库中获 得同属物种序列 14 条用于