毕赤酵母表达重组人血清白蛋白rhsa的条件优化试验研究生物学细胞生物学专业论文.docxVIP

摘 摘 要 人血清白蛋I兰t(human serum albumin，HSA)占f人血浆总蛋白的60％，具有抗凝血、 清除自由基、维持血液『F常的渗透压等功能，广泛用于抗休克与治疗烧伤、手术或意外 大出血造成的急性血容量减少。目前市售HSA均来源于人源血浆的提纯，存在产量不 足以及纯化过程难以避免血源病毒两大问题。因此，利用基因工程技术来生产重组人血 清白蛋(j(recombinant HSA，rHSA)代替人源HSA已经成为一种趋势。目前的难点主要 集中于提高rHSA的表达水平及其纯度。本文针对毕赤酵母(Pichiapastoris)在表达rHSA 过程中常用的载体．菌株组合及不同规模下影响蛋白表达水平的条件进行了初步优化试 验研究。 本文研究小同载体．菌株组合对rHSA表达水平的影响时发现：在表达rHSA时， pPICZa系列载体作为表达载体；而选用X．33菌株的rHSA表达水平要优于GSl 15和 SMDl 168菌株，说明选用x一33作为宿主菌有利于提高rHSA的表达量。 本文研究1L摇瓶规模下不同因素对rHSA表达水平的影响时发现，不同装液量、 转速、温度、pH、甲醇浓度和添加次数以及不同离子对rHSA表达水平均有影响。，最佳 表达条件为1L三角瓶中装入100mLBMGY培养基，接种量1％，转速200rpm，pit=5．5， 温度22。C，甲醇每24h添加2次，每次添加量为总体积的1％，磷酸盐浓度100mM／L， 硫酸铵浓度0．5％。最佳表达条件下，诱导240h后rHSA的表达量可达到O．59／L。此一 系列条件可以作为发酵罐规模培养条件的参考。 本文研究3L发酵罐规模下不同因素对rHSA表达水平的影响时发现，不同的基础 盐培养基、起始诱导密度、溶解氧体积分数(DO)、pH、温度、甲醇浓度等培养条件以 及诱导过程中添加额外碳源、油酸等影响因素对rHSA表达水平均有影响。最佳表达条 件为一级种子以10％的接种量接入基础盐培养基中，起始诱导密度为400，发酵过程中 保持DO在30％，诱导温度22。C，pH=5．75，甲醇电极控制甲醇浓度在1％，诱导过程 中添加甘油29／L／h，油酸添加量为0．1％，发酵全过程由发酵罐控制系统软件进行在线控 制和数据采集。最佳表达条件下，诱导288h后rHSA表达量接近59／L。 关键词：毕赤酵母，重组人血清白蛋白，条件优化 ABSTRAC ABSTRACT Human serum album(HSA)is about 60 percent of the total protein of the human plasma．It is largely responsible for maintaining the normal osmolarity of the blood stream and also have other function such anticoagulation、clean the free radicals et a1．HSA is widely used in anti—shock，treatment of bums， bleeding caused acute hypovolemia by surgery accidental．At Present，on sale HSA prepared from human plasma is limited in supply and there is the potential risk of contamination of the product by blood．drived pathogens．It is trend of replaced HSA to product rHSA by genetic engineering means．The problem is how to raise the expression level and the purity of rhsa。Preliminary studies the process of rHSA expression with different combination of vector-strains and other factors in different scale were studied in this thesis． Discused the different combination of vector-strains during rHSA expressing in this thesis，pPICZf】t is the better expression vector than others；and X一33 is th