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常见致病菌通用芯片检测方法的研究摘 常见致病菌通用芯片检测方法的研究 摘 要 目的：利用生物芯片进行细菌的高通量检测和鉴定己成为很多人的共识，但至今 为之还未真正实现。为建立细菌性生物恐怖剂和重要医学细菌的筛查方法，本研 究旨在建立一种基于16S rDNA寡核苷酸芯片的检测和鉴定常见致病菌的技术。 方法：以16S rDNA为靶标，针对待检细菌设计合成一系列寡核苷酸探针，制各 寡核昔酸芯片。由于169 rDNA的保守性，针对每个细菌的四个可变区设计出4 条探针。以本室保存的包括近缘和远缘细菌在内的135种共计300多株细菌对探 针进行了验证和筛选。根据一种含26条种特异性探针的试验芯片，对芯片的杂 交和洗涤条件等进行了摸索，并确立了新的数据分析方法。以筛选得到的探针， 重新制备新的寡核苷酸芯片。待检细菌DNA经通用引物扩增标记后，与芯片杂 交，对杂交图谱分析归纳，得到一套种／属特异的检测模式。待检样本与芯片杂 交后，结果与种／属特异的检测模式相比，根据相似性大小判断样本的种类。以 本室保存的部分样品对其进行了特异性验证。最后进行了混合样品检测试验及灵 敏度试验。 结果：针对79种靶标细菌分别设计的4条探针，共316种，以本室保存的135 种共计300多株细菌进行杂交验证，结果剔除了12个“交叉”反应严重的探针， 60个始终没有信号的探针，以及63个最初设计时即相互重复的探针后，最终确 定有效探针181个。 以含有针对7种细菌的26条探针的芯片为模型，初步探讨了利用16S rDNA 寡核苷酸芯片鉴定致病菌的可行性。在已有条件基础上，优化了杂交和洗涤条件， 缩短了杂交时间。在此基础上，分析比较了几种常见的数据分析方法，确定了以 相对信号强度为依据的信号阴阳性判断思路，以及以特异性寡核苷酸谱(杂交图 谱)为基础的细菌检测方式。结果表明，利用寡核苷酸芯片实现致病菌高通量鉴 定是完全可行的，提出的信号判断方法保证了鉴定结果的稳定性，使鉴定结果受 样品浓度及杂交过程差异等的影响程度减小，使用实验室保存的部分菌株进行初 步考核，证实其具有较强的特异性积重复性。此外，为给后续的实验选择合适的 阳性和阴性等参照，在此芯片中引入四种参照摄针进行试验，结果证实EUB338 ACTCCTACGGGAGGCAGC基本可以胜任阳性参照的作用，来源于^噬菌体 的AGAATATGGCGGCGATGCT还和部分菌种有交叉现象，不能作为阴性参照， 而p01y(T)49和50％DMSO位点的信号强度均很小，可以胜任阴性和空白参照 的作用，以作为芯片杂交和洗涤质量控制的标准之一。 以经过验证的EUB338 以经过验证的EUB338 ACTCCTACGGGAGGCAGC以及在探针验证过程 中证实交叉反应最严重的其中两个探针：Acinetobacter ham。lvtic凇(溶血不动 杆菌)的3号探针TCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATC(ID％=100％)和4 号探针AGAGAGGTAGCTTGCTACTGATCT(ID％一100％)为阳性参照，poly (T)49和50％DMSO为阴性和空白参照，加上确定的1 81个有效探针，重新设 计并制备新的检测芯片。利用通用引物8ua和907b对涉及31个属126种细菌(包 括可获得的靶标细菌，及其同属内的其他近缘细菌，和某些不作为靶标细菌，但 可供分析的菌株数较多的细菌)进行扩增和标记后，与芯片杂交，对杂交图谱分 析归纳，得到一套种(属)特异的检测模式，共计62种，分别针对不同的种、属， 或为几个种或属的混合模式。确立检测模式后，从己提取的模板库中随机选取了 包括远缘和近缘细菌在内的228份样品(104种菌)进行特异性验证。结果表明， 大部分样品可准确地鉴定到种或属的水平，没有对应模式存在者，则没有对应的 可信结果，即最大的相似性指数一般都小于75％，鉴定准确率为93．42％(213 株正确，15株错误)。该芯片检测系统不能区分李斯特氏菌(属)和除炭疽芽孢 杆菌外的大部分芽孢杆菌，这两类细菌对应的阳性信号都较少，在混合样品中也 容易被其他细菌的阳性信号所掩盖．因此针对这两类细菌可能需要进一步改变杂 交条件，或样品制备方法，以增加它们的阳性信号数量，从而增加相互之间的分 辨能力，同时在混合样品中又不致被其他细菌的杂交信号所掩盖。个别菌种检测 结果出现偏差，但由于没有对应模式存在，需要进一步验证，包括硝酸盐阴性不 动杆菌、摩氏摩根氏菌、沃氏葡萄球菌和和泰拉维沙门氏菌等。 以金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌和鼠疫耶尔森氏菌三种比较典型的致病菌 为例，研究了该芯片检测系统的灵敏度问题。炭疽芽孢杆菌和鼠疫耶尔森氏菌灵 敏度较好，30P-I体系中最低可检测到的细菌数分别为5．2×103cfu和7．1×102cfu， 金黄色葡