靶向bfgf小分子干扰rna抑制stat3磷酸化诱导人脑胶质瘤细胞系u251凋亡临床医学外科学神经外科专业论文.docxVIP

丕望堕型莶堂堡主堂垡鲨銮 丕望堕型莶堂堡主堂垡鲨銮 一 中文摘要 多形性胶质母细胞瘤(GBM)是成人恶性程度最高的颅内原发性肿瘤，尽管目 前的治疗手段已有很大突破，但是由于GBM颅内高度浸润生长的特性，肿瘤细 胞分子调控机制错综复杂，其临床预后仍然很差。碱性成纤维细胞生长因子 fbFGF)在GBM中高表达，且与肿瘤的生长，增殖，血管发生密切相关，已成为 GBM基因治疗中一个有前景的靶向分子。前不久，本课题组成功报道了bFGF 小分子干扰RNA的腺病毒载体(Ad．bFGF．siRNA)在体内外实验中均显示出能抑 制恶性脑胶质瘤的生长，并增加了胶质瘤细胞系U251的化疗敏感性，然而其确 切的分子机制并不清楚。信号转导子与转录激活子3(STAT3)在胶质瘤中过度活 化，与肿瘤的分级呈正相关。此外，STAT3也是众多生长因子和细胞因子激活 的信号转导通路汇合交叉的中间转录因子，参与调节肿瘤的增殖、生存、转移、 血管生成、免疫应答等过程。因此可以假设，Ad．bFGF．siRNA可能通过抑制 STAT3通路的磷酸化，从而表现抗增殖，促凋亡的特性。 本课题研究，主要包括三个方面： 首先，探讨与STAT3有关的信号转导途径的变化。选取多形性胶质母细胞 瘤细胞系U251，转染Ad．bFGF．siRNA，分别孵育24、48、72h，提取总蛋白， 采用Western blot方法，在三个时间点检测了目的基因STAT3，pSTAT3(Ser727) 及pSTAT3 fTyr705)的表达情况，并选取三条与STAT3相关的经典信号通路： JAK．STAT3、Ras．Raf-MEK．MAPK(ERK)及Src信号通路，测定其上游的关键蛋 白及下游细胞周期及凋亡蛋白表达量的变化，初步探讨了重组腺病毒 Ad．bFGF．siRNA影响STAT3信号转导途径的可能性。整个实验均以DMEM和 空载腺病毒孵育组作为对照，结果显示，Ad．bFGF．siRNA能够抑制STAT3蛋白 的磷酸化水平，且呈时间依赖性。三个时间点，STAT3总蛋白、ERKl／2总蛋白 及JAK2总蛋白量基本保持不变，pSTAT3(Tyr705)酐J表达从转染24．72h一直受 到抑制，pSTAT3(Ser727)表达量在转染24和48h减少，但是转染72h恢复到未 转染时的水平，pERKl／2蛋白的变化基本与pSTAT3(Ser727)保持一致，pJAK2 的变化与pSTAT3(Tyr705)的变化一致，Src总蛋白和pSrc均只在转染48h表达 减少，作为STAT3下游的效应蛋白，CyclinDl和Bcl．xl在转染72h后显著下降， 综上，Ad．bFGF．siRNA抑制了U25 1细胞的JAK2．STAT3、Ras．Raf-MEK．MAPK (ERK)I拘活化通路，进而抑制了中间转录分子STAT3的磷酸化，和下游的效应分 天津医科大学硕士学位论文子CyclinDl和Bcl．xL，而对Src的活化可能无影响。 天津医科大学硕士学位论文 子CyclinDl和Bcl．xL，而对Src的活化可能无影响。 其次，探讨细胞外分泌的与STAT3密切相关的细胞因子水平变化。因为IL-6 是STAT3的强烈激活物。本课题采用酶联免疫吸附试验(ELISA)，测定转染 Ad．bFGF．siRNA后分别孵育0-24h、24．48h、48．72h细胞上清液中IL-6水平的 变化，结果显示，与对照组相比，Ad．bFGF．siRNA能够显著减降低IL一6水平。 用重组的人IL．6刺激已用Ad．bFGF．siRNA转染48h的U251细胞，作用24h后， 采用Western blot方法检测pSTAT3(Tyr705)币D pSTAY3(Ser727)的变化，结果发现， 外源性IL．6刺激可逆转Ad．bFGF．siRNA转染诱导的pSTAT3 fTyr705)和 pSTAT3(Ser727)的下调。提示，Ad—bFGF—siRNA能够抑制胶质瘤细胞分泌IL．6：， 而且STAT3活化下调可能与IL．6表达的降低有关。 最后，探讨可能的凋亡途径。采用流式细胞仪和免疫荧光检测 Ad-bFGF．siRNA处理72h后，线粒体膜电位的变化，并用Westem blot方法检测 下游的与线粒体途径相关的凋亡分子Cytochrome C、Caspase3、Bax变化，结果 显示，Ad—bFGF．siRNA能够显著减低U251细胞线粒体膜电位，并且增加了 Cytochrome C、Caspase3、Bax一的表达，表明Ad．bFGF．siRNA可能诱导U251细 胞发生线粒体相关的凋亡。 综上所述，可以得出如下结论： 腺病毒介导的bFGF小干扰RNA通过抑制IL．6的分泌，减少了多形性胶质 母细胞瘤细胞系U251的S