肺表面活性蛋白在prrsv感染猪肺组织中的表达基础兽医专业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文2．2．4质粒转染 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 2．2．4质粒转染 ．17 2．2．5高表达SP．A、SP．D稳转细胞系的筛选 ．．17 2．2．6从细胞培养上清中纯化SP．A和SP．D ．18 2．2．7 PRRSV的增殖与病毒滴度的测定 19 2．2．8重组SP-A和SP．D与PRRSV结合活性测定 。19 2．2．9重组SP-A和SP．D抑制PRRSV感染Mare．145细胞 20 2．2．10荧光定量PCR 。20 2．2．1 1 Westem blot ． ． 21 2．2．12双荧光素酶报告系统检测SPs之间相互作用 ．．22 2．2．13统计学分析 ．22 3 结果与分析 23 3．1 SP-A、SP．D结合PRRSV及抑制其感染的研究 23 3．1-1 SP-A、SP—D真核表达载体的构建 23 3．1．2 SP—A、SP．D稳转CHO细胞系的筛选及鉴定 24 3．1．3 Western blot鉴定细胞培养上清中纯化SP-A、SP．D蛋白 ．26 3．1．4 SP-A、SP．D与PRRSV体外结合活性测定 26 3．1．5 SP-A、SP．D抑制PRRSV感染Marc．145细胞 。27 3．2 PRRSV感染猪肺组织中SPs的表达 28 3．2．1 PRRSV感染猪肺组织中SPs的表达变化 28 3．2．2 GPRl 16在PRRSV感染猪肺组织中的表达 29 3．2．3断奶应激仔猪肺组织中表面活性蛋白的表达 ．30 3．3 SP-C和sP-D之间相互作用的研究 ．．3 l 3．3．1 sP—C启动子双荧光素酶报告载体的构建 32 3．3．2超表达SP-D对SP-C启动子活性的影响 ．32 4 讨论 ．34 4．1 SP-A、SP-D结合PRRSV及抑制其感染的研究 34 4．2 PRRSV感染猪及断奶应激仔猪肺组织中SPs的表达 34 4．2．1 PRRSV感染猪肺组织中SPs的表达 34 II 万方数据 肺表面活性蛋白在PRRSV感染猪肺组织中的表达4．2．2 肺表面活性蛋白在PRRSV感染猪肺组织中的表达 4．2．2 GPRl 16在PRRSV感染猪肺组织中的表达 35 4．2．3断奶应激仔猪肺组织中SPs的表达 ．35 4．3 SP．C和SP．D的相互作用 36 5 结论 ．．37 参考文献 38 致谢 45 llI 万方数据 肺表面活性蛋白在PRRSV感染猪肺组织中的表达摘要 肺表面活性蛋白在PRRSV感染猪肺组织中的表达 摘要 肺表面活性物质(Pulmonary suffactant，PS)是肺泡II型上皮细胞分泌的一种复 杂的脂蛋白复合物，其中蛋白成分称为表面活性蛋白(Surfactantprotein，SP)，总共 有四种，分别是sP．A、SP．B、SP．C和SP．D。SP．A和SP．D是亲水性蛋白，属于胶 原凝集素，能够与多种病原发生非特异性结合，并呈递给巨噬细胞，介导病原的清 除，是参与肺脏天然免疫的重要分子；SP．B和SP．C是疏水性蛋白，有维持脂质体 在肺泡表面的分布，降低肺泡表面张力的功能。 猪繁殖与呼吸综合症(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是 危害养猪业的重要问题，由猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome Virus，PRRSV)感染引起的，其宿主细胞是肺泡巨噬细胞， PRRSV的感染会引起猪肺脏呼吸功能的紊乱。 SP．A和SP．D作为参与肺脏免疫的重要分子，它们是否具有抵御PRRSV感染 的功能还不清楚；PRRSV感染会引起猪呼吸系统功能紊乱，SPs作为维持肺脏正常 功能的重要分子，它们在PRRSV感染中的变化目前也不清楚。主要研究内容如下： 1．SP．A和SP．D参与PRRSV的免疫 通过CHO(Chinese hamster ovary,CHO)真核表达系统获取了sP．A和SP．D， 并对它们结合及抑制PRRSV感染的活性进行了测定，发现SP．A和SP．D均能够结 合PRRSV并且抑制PRRSV感染Marc．145细胞。 2．SPs在PRRSV感染猪肺组织中的表达 qPCR的检测PRRSV感染猪肺组织中SPs mRNA的表达，发现PRRSV感染猪 肺组织中SPs的表达出现紊乱。与正常组相比PRRSV感染猪肺组织中SP．A表达升 高但不显著，SP．D的表达显著升高，而SP．C的表达显著降低。结合不同日龄断奶 仔猪肺组织中SPs的表达变化，发现SP．C和SP．D的表达呈负相关性，通过带有SP．C 启动子的双荧光素酶报告载