弓形虫自杀性dna疫苗及重组杆状病毒疫苗研究预防兽医学专业论文.docxVIP

IIll IIll l l tltl ltl l U I t tl III Y1 805327 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 雪 如需保密，解密时间 年 月 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果．尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意． 碱蜷各锄 帆缈年占月夕日 签名日期：训年f月‘7日 签名日期：∥．，年b月 ／日 ●_●。。一 ●_●。。一 弓形虫自杀性DNA疫苗及重组杆状病毒疫苗研究目 弓形虫自杀性DNA疫苗及重组杆状病毒疫苗研究 目 录 目j录 ．I 中文摘要 1 Abstract ： ．3 缩略语表(Abbreviation) 6 1．文献综述 8 1．1弓形虫与弓形虫病的发现及其危害 8 1．1．1弓形虫与弓形虫病的发现 ．．8 1．1．2弓形虫病的危害 ．8 1．2弓形虫的传播 10 1．3弓形虫的免疫应答 11 1．3．1先天免疫 11 1．3．2获得性免疫 11 1．4弓形虫病的疫苗研究进展 ．12 1．4．1被动免疫 1 2 1．4．2弓形虫灭活疫苗 1 2 1．4．3弓形虫弱毒苗 12 1．4．5亚单位疫苗 _ 20 1．4．6基因工程活载体疫苗 23 1．4．7基因缺失疫苗 25 1．4．8“Coketail”疫苗 ．25 1．4．9 T细胞疫苗 ．．30 1．5弓形虫病的疫苗发展的机会与挑战 ．30 1．6自杀性DNA疫苗表达载体简介 38 1．7重组杆状病毒表达载体简介 ．39 2．研究的目的与意义 42 3．材料与方法 ．44 3．1试验材料 ．44 3．1．1菌株、虫株、细胞及实验动物 44 3．1．2载体与质粒 44 3．1．3主要药品及试剂 ．46 3．1．4培养基与抗生素及其配制 47 3．1．5缓冲液 48 3．2实验方法 ．50 弓形虫自杀性DNA疫苗及重组杆状病毒疫苗研究3．2．1限制性内切酶酶切反应 弓形虫自杀性DNA疫苗及重组杆状病毒疫苗研究 3．2．1限制性内切酶酶切反应 ．50 3．2．2 PCR产物或酶切产物的电泳检测 50 3．2．3 PCR产物或酶切产物回收与纯化 5l 3．2．4外源DNA片段与质粒载体的连接反应 ．．5l 3．2．5大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) ．．52 3．2．6连接产物的转化 ．52 3．2．7质粒的制备与鉴定 ．．52 3．2．8质粒转染(脂质体介导转染法) ．55 3．2．9构建重组杆状病毒的操作流程及示意图 ．55 3．2．10重组穿梭载体(Bacmid)的构建 ．57 3．2．11重组穿梭载体(Bacmid)的提取 57 3．2．12重组杆状病毒获得 57 3．2．13重组杆状病毒转导PK．15细胞 ．．57 3．2．14间接免疫荧光试验(IFA)检测目的蛋白的体外表达 ．57 3．2．15 ELISA操作步骤 58 3．2．16细胞免疫的检测 58 3．2．17动物试验 60 3．2．1 8统计学方法 ．61 4．结果和分析 62 4．1表达弓形虫MIC3基因的自杀性DNA疫苗的构建及免疫原性的研究 62 4．1．1弓形虫MIC3基因的PCR扩增 62 4．1．2重组质粒的构建和鉴定 62 4．1．3基因序列的测定与分析 63 4．1．4．间接免疫荧光检测自杀性DNA疫苗pSCA．MIC3中MIC3基因的表达 65 4．1．5免疫小鼠的抗体水平检测 ．65 4．1．6免疫小鼠淋巴细胞增殖检测 ．66 4．1．7 Real-time PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN吖和IL．4 mRNA表达相对 定量分析 67 4．1．8自杀性DNA疫苗pSCA．MIC3对小鼠的免疫保护性试验 68 4．2杆状病毒介导的表达弓形虫MIC3、SAGl基因的重组毒疫苗的构建及免疫原 性的研究 ．．68 4．2．1 pcDNA．MIC3和pcDNA．SAGl真核表达质粒的构建 68 4．2．2 pFast．VSVG—CMV-MIC3和pFast-VSVG．CMV-SAGl转移质粒的构建 ． ．． ．． ．．．． ． ．．． ．． ．． ．． ． ． ． ． ． ． ． ．．．．69 n 4．2．34．2．4 4．2．3 4．2．4 4．2．5 4．2．6 中的 4．2．7 4．2．8 4．2．9 4．2．10 ELISA检测免疫小鼠脾细胞中IFN吖、IL．4和IL．10 m表达水平