tgr5在高糖诱导小鼠心肌细胞凋亡中的作用及其机制内科学专业论文.docxVIP

目 目 录 TGR5在高糖诱导小鼠心肌细胞凋亡中的作用及其机制 1 1．1 中文摘要 1 1．2 英文摘要 5 1．3 前言 1 O 1．4 材料与方法 12 1．5 结果 29 1．6 讨论 39 1．7 结论 44 1．8 参考文献 45 1．9 英汉缩略词对照表 49 2 致谢 50 3 TGR5是新型的代谢调节因子(综述) o ．．51 万方数据 四趔医科太堂亟±堂焦迨塞f唧燃眇TGR5在高糖诱导小鼠心肌细胞凋亡中的作用及其机制宰 四趔医科太堂亟±堂焦迨塞f唧燃眇 TGR5在高糖诱导小鼠心肌细胞凋亡中的作用及其机制宰 摘 要 背景：201 1年1 1月国际糖尿病联盟(IDF)公布的数据显示，中国糖 尿病患者己超过9000万，位居世界第一，预计到2030年患病人数将增至 1．3亿【11。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)作为糖尿病独立的 并发症目前己被肯定，并逐渐被流行病学专家和临床医生所重视。目前认 为糖尿病心肌病导致细胞凋亡的发生主要与以下机制有关：(1)心肌能量 代谢异常，主要是心肌对糖脂利用异常，表现为心肌对脂肪的利用增加， 对糖的利用减少。 (2)细胞内钙调控异常。 (3)微血管病变和微循环障 碍。(4)高血糖时氧化应激增加，信号转导途径改变，激活细胞程序化死 亡[21。尽管糖尿病心肌病的发病机制尚未明确，但氧化应激在糖尿病心肌 病发生及发展中的地位和作用，己被大家所肯定[31。高血糖所诱导的氧化 应激是启动并贯穿糖尿病心肌病整个阶段，也是引起心肌细胞凋亡和坏死 的重要损伤因素【41。 G蛋白偶联胆汁酸受体I(G protein—coupled bile acid receptor 1，TGR5、) 是一种特殊的胆汁酸膜受体，在胆汁酸信号网中起着重要作用。近年来的 研究证实，它的激活可以改善机体能量代谢，减轻氧化应激及炎症反应【51。 因此TGR5可能成为治疗糖尿病心肌病的新靶点。已有研究证实TGR5广 泛表达于多种组织中，如棕色脂肪组织，肝脏，肌肉和中枢神经系统等， 但表达水平在各种组织中有明显差异，其最高表达在胆囊，心肌细胞上也 有表达【6】。 本课题以乳小鼠心肌细胞为研究对象，运用现代分子生物学技术，探 讨在高糖环境下，激动心肌细胞膜上的TGR5受体后，对心肌细胞凋亡的 +本课题源自国家自然科学基金资助项目(No．3 1300946) -1- 万方数据 影响，并研究其可能的机制。目的：本实验以-孚Ld,鼠-fl,肌细胞为研究对象，探讨激动心肌细胞细胞 影响，并研究其可能的机制。 目的：本实验以-孚Ld,鼠-fl,肌细胞为研究对象，探讨激动心肌细胞细胞 膜上TGR5受体，能否减轻高糖对心肌细胞的损害及其可能的机制，从而 丰富糖尿病心肌病的理论基础及探索新的治疗思路。 方法：1．乳小鼠心肌细胞的原代培养。无菌条件下取得-孚Ld,鼠心脏， 清洗后加入胰酶40C过夜，次日终止消化，再用配制的胶原消化液分次消 化得到单个心肌细胞，收集细胞接种于培养皿内，差时贴壁法除去心肌成 纤维细胞，得到纯度相对较高的心肌细胞用于本实验。2．高糖致心肌凋亡 模型的建立。心肌细胞在对照组血糖浓度(5．5mmol／L)培养基中培养2．3 天后，选取贴壁细胞密度在90％以上，搏动节律于120．140次／min的心肌 细胞用于实验。用高糖(40mmol／L)培养基干预心肌细胞72 h后，运用流 式细胞仪技术检测心肌细胞与正常组的凋亡差异是否具有统计学意义。3． 实时定量PCR检测心肌细胞膜上TGR5 mRNA及HO．1 mRNA的表达按 照实验设计，不同组心肌细胞干预好后，分别提取各组心肌细胞RNA，通 过对RNA的浓度及纯度鉴定好后，进行cDNA的反转录合成，从Gene Bank 中查阅目的基因的序列号，运用计算机软件PrimerPremier 5．0设计相应引 物，上机进行目的基因的荧光定量检测。4．运用Western blot方法检测心肌 细胞膜上TGR5蛋白的表达。按照实验设计分好组，用不同的干预处理心 肌细胞后，裂解细胞，分别提取各组细胞膜蛋白，运用BCA方法测定得到 的蛋白浓度，以Tubulin为内参，将处理好的蛋白质样品进行分离、转膜、 封闭，依次孵育一抗和二抗、显色、成像后，将获得图像用图像处理软件 Quantity One测定并分析条带灰度值以检测目的基因蛋白的表达水平。 5．shRNA沉默心肌细胞膜上TGR5基因细胞浓度约2×107／孔，分别接种 于六孔板内，正常培养3天，当贴璧细胞达到90％，取状态良好的细胞进 行实验。Polybrene转染剂按照5 rtg／mL浓度与高糖+激动剂培养基混匀， 室温孵育1 5min，取shRNA稀释液20“1液加入培养孔