补肾清热毒方治疗狼疮性肾炎的疗效与机理的实验研究中医临床基础专业论文.docxVIP

中文摘要中 中文摘要 中 文 摘 要 系统性红斑狼疮(SLE)是严重危害人类健康的自身免疫性疾病。肾脏是该病最常受 累的器官(称为狼疮性肾炎，LN)和主要死亡原因。目前该病的发病机制尚未明了，从中 医理论出发，结合现代医学探讨LN的发病机制及治疗方法已成为该病研究的一个重要方 向。本课题参照Bergjk报道的方法成功诱导了慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼疮样小鼠 模型，在此基础上，观察临床上证实有较好疗效的中药方剂补肾清热毒方对cGVHD模型的 作用，并进一步从细胞凋亡及Th亚群功能失衡方面探讨LN的发病机制和补肾清热毒方发 挥作用的分子机制。 本课题分四部分进行： 1．cGVHD狼疮样小鼠模型的诱导 选用6-8周龄的(DBA／2×C57BL／6J)F1小鼠，通过尾静脉注射雌性DBA／2小鼠的淋 巴细胞制作模型。取雌性DBA／2小鼠的脾、胸腺、淋巴结制成淋巴细胞混悬液，注射时间 是0、3、7，10天，每次注射50X105个活细胞。于注射后0、2、4、8、10、12周检测尿 蛋白浓度并处死部分小鼠，分别取血及肾脏标本，测定抗dsDNA自身抗体、血肌酐、尿素 氮、血脂和观察肾脏病理改变。尿蛋白浓度用考马斯亮蓝法，自身抗体用间接免疫荧光法， 肾组织制成石蜡切片后，经PAS、Masson、PAM染色光镜下观察病理改变，同时用透射电镜 观察肾组织超微结构变化。结果Fl小鼠注射母鼠淋巴细胞后2周产生抗dsDNA自身抗体， 出现蛋白尿，4周血脂、血肌酐、尿素氮轻度升高(PO．05)，肾脏病理仅有系膜细胞轻度 增生，未见间质损害。8周血肌酐等血生化指标明显改变，肾脏病理示肾小球系膜细胞中 度增生，间质炎细胞浸润和肾小管大量蛋白管型，10-12周尿蛋白浓度、抗dsDNA自身抗 体、血肌酐、尿素氮、胆固醇、甘油三脂明显升高(PO．05或PO．01)，白蛋白明显降 低(PO．01)，病理出现局灶或弥漫肾小球硬化，免疫荧光示IgG、IgM、C3沿毛细血管壁 及系膜区沉积。模型组电镜下可见系膜区免疫复合物沉积。实验结果表明cGVHD狼疮样小 鼠模型类似人类狼疮性肾炎，是良好的狼疮性肾炎模型。 2．补肾清热毒方对cGVHD狼疮样小鼠模型的疗效观察 模型雌鼠于诱导后第4周，随机分为补肾清热毒方组(10只)，强的松组(10只)， 模型组(6只)及未诱导的Fl对照组(6只)，用药8周后处死，观察小鼠血清抗dsDNA 抗体、血肌酐，尿素氮、血脂及肾脏病理改变等指标。结果显示，经补肾清热毒方和强的 松干预后，尿蛋白浓度、抗dsDNA抗体、血肌酐、尿素氮均有降低(PO．05或PO．01)， 白蛋白升高(PO．05)，而补肾清热毒方尚有降低胆固醇作用(PO．05)，两药对系膜细胞增 生及间质炎细胞浸润有减轻作用(PO．05)，表明补肾清热毒方对cGVHD狼疮样小鼠模型具 有良好的的治疗作用。 3．补肾清热毒方对c6VHD狼疮样小鼠模型肾组织细胞凋亡的调节作用 ．2． ．2． 补肾清热毒方治疗报疮性肾炎的疗效与机理的实验研究 按实验二方法进行分组并用药，采用原位末端标记法(TUNEL)染色观察肾组织细胞 凋亡；免疫组化、western blot和RT-PCR技术检测Fas、FasL基因转录及蛋白表达情 况。结果表明补肾清热毒方可增加肾组织TUNEL阳性积分，上调Fas、FasLmRNA和蛋白水 平，提示补肾清热毒方治疗LN的作用可能是通过上调Fas、FasL，促进细胞凋亡实现的。 4．补肾清热毒方对cGVHD狼疮样小鼠模型Th!,iTh2细胞因子的影响 按实验二方法进行分组并用药，采用放射免疫法检测外周血IL一2、TNF—a、IL一6水 平，结果补肾清热毒方对促进Thl细胞分化，从而加重免疫反应的IL一2，及前炎症因子IL一6、 TNF—n均有抑制作用，表明补肾清热毒方对细胞因子5I起的炎症反应有抑制作用。采用免 疫组化和RT—PCR方法检测肾组织IL-4、IN卜r蛋白及mRNA的表达，以观察补肾清热毒 方对肾组织Thlffh2的影响，结果补肾清热毒方可下调肾组织IL一4水平，且INF-7／IL一4 比值与正常对照组比值相近，表明补肾清热毒方具有调节Thl／Th2细胞因子平衡的作用。 以上研究结果表明，cGVHD狼疮样小鼠模型肾组织细胞凋亡异常及Thl／Th2细胞因子 失衡，在狼疮性肾炎的发病中起重要作用。补肾清热毒方通过影响肾组织细胞凋亡，调节 凋亡调控基因Fas、FasL以及Thl／Th2细胞因子平衡两种机制而减轻肾脏病理损伤，这可 能是该方取得疗效的分子机制之一。 主题词：狼疮性肾炎慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠模型补肾清热毒方 细胞凋亡细胞因子 茎奎塑墨 茎奎塑墨 一j。 Effects and Renoprotective Mechanisms of Bu