反义mcp1对系膜增生性肾炎防治作用的实验研究儿科学专业论文.docxVIP

摘要目的在’肾小球肾炎中，炎症细胞的浸润可引起和加重肾小球的 摘要 目的在’肾小球肾炎中，炎症细胞的浸润可引起和加重肾小球的 病理损伤。单核细胞趋化蛋白一l(Monocyte Chemoattraotant Protein—l，MCP-1)具有诱导单核细胞趋化和激活单核细胞的双重功 能，与肾小球的炎症细胞的浸润密切相关。晚近的研究表明：MCP—l 除了趋化单核细胞外，还参与活化某些肾固有细胞，因此认为MCP— l在肾小球炎症中是一个多功能因子。本研究旨在通过基因转导技术 探讨抑制MCP一1的功能对肾小球固有细胞的增生及细胞外基质的影 响。 方法首先构建McP一1基因的重组逆转录病毒反义pLXSN／MCP—l 质粒。用RT—PCR技术从大鼠系膜细胞中扩增出MCP—IoDNA，将其 与pGEM—TE连接，DNA测序。用限制性内切酶EcoR I对pTg—MCP一1 和逆转录病毒质粒pLXSN分别进行酶切。在T4连接酶的作用下，构 建重组逆转录病毒质粒pLXSN／MCP-1。经Bgl II，Xho I酶切鉴定MCP 一1在质粒中的方向并测序证实。用脂质体介导的方法把反义重组质 粒DNA转染进入包装细胞PA317中，经过G418筛选出抗性克隆。通 过NIH3T3细胞测定病毒液的病毒滴度。 然后将逆转录病毒感染体外培养的系膜细胞，得到转染反义MCP 一1的系膜细胞，经PCR及Southern blot鉴定外源基因在系膜细胞 基因组DNA上的整合。并用脂多糖(1ipopolysaccharide LPS)刺激 反义McP一1系膜细胞，以正常系膜细胞及转染空白载体的系膜细胞 为对照，观察其增生，用RT—PCR检测MCP—l、CCR2的mRNA的表 达及用酶联免疫吸附法检测细胞上清中McP—l蛋白的分泌变化。 最后将体外培养的反义MCP—l系膜细胞经肾动脉注射到大鼠的 系膜增生性肾小球肾炎模型中，用原位杂交的方法检测外源细胞在肾 脏的存在。同时设对照组，观察反义MCP一1系膜细胞对肾炎大鼠的 蛋白尿、病理损伤的影响，用RT—PCR检测肾脏中MCP—l、CCR2、 TGF—B。的mRNA表达，免疫组化的方法检测MCP—l、TGF一13．的蛋 白在肾脏的病理切片上的表达。 结果经过RT--PCR技术从大鼠系膜细胞中扩增出MCP—lcDNA 与所需的大小一致。重组质粒经酶切分析与预期的结果一致。G418 筛选出PA317细胞克隆，能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒。 NIH3T3细胞测定病毒滴度为1 7×104 CFU／ml。 经逆转录病毒转染得到的反义MCP—l的系膜细胞，其基因组DNA 经逆转录病毒转染得到的反义MCP—l的系膜细胞，其基因组DNA 中有外源基因的整合。在正常的培养条件下，系膜细胞的生长反义组 与对照组没有差异，McP一1、CCR2的mRNA均有少量表达，McP一1 的蛋白表达也很微弱。在LPS的刺激下，与对照组比较，反义组系膜 细胞的增生受抑制，MCP—l的mRNA的表达增高，与对照组比较下降， MCP一1蛋白的分泌增多但较对照组减少；CCR2的mRNA表达与McP一 1有相同的变化。 在系膜增生性肾炎模型，原位杂交证实注射的外源系膜细胞在‘肾 小球有存活；注射反义系膜细胞的反义组与对照组比较，可减少蛋白 尿及肾小球的系膜细胞增生；反义组MCP—l、CCR2、TGF—B．的mRNA 表达均减少，肾脏的病理切片MCP—l蛋白的表达减少，且有统计意 义。 结论①逆转录病毒载体pLXSN可有效地介导McP—lcDNA在系 膜细胞的转染，系膜细胞可作为外源基因进入肾脏的载体。②反义 MCP—l可降低系膜细胞McP一1的转录和翻译。③反义MCP一1的转 染可降低系膜细胞在炎症状态时的增生。④大鼠系膜细胞具有CCR2 的表达，在炎症状态时形成McP—l、CCR2的自分泌环路。⑤反义 McP—l可减轻系膜增生性肾炎模型的病理损伤。⑥反义McP一1减 轻系膜增生性肾炎模型的病理损伤是通过降低MCP一1、CCR2的表达 完成的。⑦MCP一1引起肾小球的基质增生，并不完全依靠TGF—B。 的作用完成。 关键词单核细胞趋化蛋白一1，逆转录病毒，系膜细胞，系膜增生 性肾小球肾炎 AB AB STRACT Objective In glomerulonephritis accumulation of circulating inflammatory ceils induce glomerular lesions from acute phases to chronic phases．Monocyte Chemoattractant Protein-1，(MCP-1)a chemoattractant for monocytes and T ly