高温纤维素酶产生菌的筛选鉴定及其基因克隆和酶学性质研究微生物学专业论文.docxVIP

‘白 ，? ， 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：j牡日期：珥 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 论文作者签名：年导师签名：恤日(保密论文在解密后应遵守此规定) 期：叫 ‘ I 摘要 摘要 · Abs臼．act ” 第一章绪 1．1纤维 1．1．2 1．1．3 1．1．4 1．1．5 1．2可降 1．3耐热 1．4耐碱 1．5纤维 1．5．1 1．5．2非复合型纤维素酶系统 ．．19 1．6蛋白质工程 -．2l 1．6．1定向进化 21 1．6．2理性设计 一22 1．7本文的研究意义及研究内容 “24 第二章高温纤维素降解菌的筛选及鉴定 一26 引言 26 2．1材料与方法 ”26 2．1．1筛菌取材来源 一26 2．1．2培养：基 26 2．1．3筛菌过程 27 2．1．4纤维素酶酶活的测定 。27 2．1．5菌种鉴定 ．．28 2．2结果与讨论 ”29 2．2．1初筛及复筛结果 。29 2．2．2菌株鉴定 1 30 I 山东大学硕士学位论文2．3本章小结 山东大学硕士学位论文 2．3本章小结 ．．35 第三章砀P册D6莎幽加c口W．-5产纤维素酶研究 36 引言 ．．36 3．1材料与方法 36‘ 3．1．1培养基 ．．36 3．1．2粗酶液性质研究 ．．37 3．1．3碳、氮源对菌株产酶能力的影响 ．．37 3．2结果与讨论 ．．37 3．2．1砌e册D6咖妇加c口W二5的粗酶液最适反应pH研究 37 3．2．2砌P删D6西妇血譬c口W二5最适反应温度研究 38 3．2．3砀删D6析出伽c口W二5的粗酶液温度稳定性 ．．39 3．2．4培养基碳源、氮源对砀P删D6狮出丘，c口W二5产酶的影响 40 3．3本章小结 ．．4l 第四章Z加∞W．．5纤维素酶基因化协和cP巧6的克隆及原核表达 42 1●—．L． 弓l舌 一42 4．1材料与方法 42 4．1．1菌株与质粒 一42 4．1．2工具酶与生化试剂 43 4．1-3培养基 一43 4．1．4 c棚6及∞西6基因的克隆 一43 4．1．5异源表达载体的构建 ．．45 4．1．6基因cP，96与c彬6的原核异源表达 45 4．2结果与讨论 47 4．2．1基因ce，96的克隆、基因分析及其表达载体的构建 47 4．2．2 Cel9B的相关酶学性质检测 ．=．．_ 52 4．2．3基因c扔6的克隆、基因分析及其表达载体的构建 54 4．2．4 Cel5B相关酶学性质检测 58 4．3本章小结 ．．60 第五章定点突变探索Cel9B及Cel5B的耐高温及耐碱机制 62 弓I言 ”62 Ⅱ 5．1材料与方法 5．1材料与方法 62 5．1．1菌株、质粒及培养基 一62 5．1．3引物序列 63 5．1．4蛋白纯化所用试剂 ．．63 5．1．5实验方法 ．．64 5．2结果与讨论 66 5．2．1 Cel9B的结构域缺失突变 66 5．2．2 Cel9B及Cel5B同源模建及活性中心位点分析 72 5．2．3 Cel9B定点突变研究 77 5．2．4 Cel5B定点突变研究 8 l 5．3本章小结 ”86 附录 88 参考文献 90 致{射 ·96 m 山东大学硕士学位论文摘要 山东大学硕士学位论文 摘要 纤维素是自然界分布最广泛，最廉价的可再生资源，纤维素酶是纤维素生物 质转化为直接能源的关键，纤维素酶的研究也是近年来世界范围内的一个热点。 本文从高温堆肥中分离得到了多株纤维素降解菌，其中包括细菌、真菌及放 线菌。经过复筛，得到了三株具有优良产酶特性的菌株，并分别进行了鉴定，包 括菌株的形态特征、菌落培养特征、系列生化鉴定及16s rDNA分子鉴定，鉴定 结果是：菌株W一5为褐色高温双歧菌(砌8删D6班如／狐阳)，命名为砀e删D6孵妇 ．胁c口W二5，菌株F．7为白色高温双歧菌(砀e删D6咖妇口，6口)，命名为砌e朋D6必妇 口，6口F．7，菌株S．1为青绿色糖单孢菌(鼬∞五口阳朋D刀D印D厂口v护池￡)，命名为 勋ccJij口阳聊D门DspD阳v以加S．1。对菌株勋