纺锤体检查点及细胞周期相关基因在卵巢癌细胞对紫杉醇获得性耐药中的作用妇产科学妇科肿瘤专业论文.docxVIP

浙江大学博士学位论文纺锤体检查点及细胞周期相关基因在卵巢癌 浙江大学博士学位论文 纺锤体检查点及细胞周期相关基因在卵巢癌 细胞对紫杉醇获得性耐药中的作用 浙江大学医学院 妇产科学 2003级博士研究生 傅云峰 导师 谢幸教授 中文摘要 研究背景 卵巢癌仍然是迄今致死率最高的妇科恶性肿瘤，总的5年生存率为44％，其中晚 期病例不足30％。自从90年代紫杉醇成为最主要的一线化疗药物以来，晚期卵巢癌 的近期缓解率已达到80％以上，但大多数患者在2～3年内复发，几乎所有复发性卵 巢癌对再次化疗耐药，化疗耐药已成为卵巢癌患者治疗失败和死亡的主要原因。 紫杉醇丰要通过与细胞13微管蛋白结合，促进微管聚合，使其稳定，使细胞阻 滞于G：／M期，进而以P53依赖性和非依赖性途径介导细胞凋亡。目前认为肿瘤细胞对 紫杉醇耐药的可能机制主要包括：P糖蛋白(P-gp)等膜转运分子表达上调导致细胞内 药物浓度降低；B微管蛋白表达改变；抗凋亡蛋I!IBcl一2表达上调等凋亡信号途径调 控异常。尽管体外研究阐明的耐药机制越来越多，但一系列针对这些可能机制而设 计的临床试验的效果非常有限，提示与传统的耐药机制不同的其他分子机制可能在 肿瘤细胞获得紫杉醇耐药性的过程中发挥更重要作用。 近年研究表明，紫杉醇的细胞毒敏感性可能与细胞周期的纺锤体检查点 (spindle checkpoint)的功能状态有关。纺锤体检查点，又称为有丝分裂纺锤体组 装检查点，是细胞自身确保染色体精确分配、维持基因组稳定性的主要“质控机制”。 纺锤体检查点通过生成后期促进复合体(anaphase—promoting complex／cyclosome， APC／C)的抑制分子一～有丝分裂检查点复合体(mitotic checkpoint complex， McC)，阻滞细胞进入分裂后期直到所有染色体着丝点正确与微管联接。APC是一种E3 2 浙江大学博士学位论文泛素连接酶，活化的APC通过一系列细胞内级联反应使姐妹染色单体分离，细胞进入 浙江大学博士学位论文 泛素连接酶，活化的APC通过一系列细胞内级联反应使姐妹染色单体分离，细胞进入 分裂后期，完成有丝分裂。几个高度保守的蛋白，包括：Madl、～lad2(mitotic arrest deficient)、 Bubl、 Bub3(budding uninhibited benzimidazole)、 BubRl(Bubl—related)和Mpsl(monopolar spindle 1)是哺乳动物细胞执行纺锤体检 查点功能所必需的，其中Mad2和BubRl是最重要的纺锤体检查点组分。 关于纺锤体检查点与抗微管类化疗药物敏感性之间的关系是近年肿瘤化疗耐药 研究的一个前沿课题，但在仅有的几个研究中结果尚存在矛盾。如Sudo发现，向乳 腺癌McF一7细胞系短暂转染Mad2或BubRl短片段干扰RNA(small interfering RNA， siRNA)可使细胞纺锤体检查点功能缺失，进而抑制紫杉醇诱导的细胞死亡。但组蛋 白去乙酰酶抑制剂曲古菌素A(trichostatin A，TSA)通过抑制细胞的纺锤体检查点 功能却增强包括紫杉醇在内的抗微管药物的杀瘤效应。Tao等也发现，能维持长时间 纺锤体检查点信号(即纺锤体检查点功能较好)的结肠癌细胞HT29更不易被紫杉醇和 驱动蛋白纺锤体蛋白(kinesin spindle protein，KSP)抑制剂杀伤。因此，肿瘤细 胞的纺锤体检查点功能与抗有丝分裂药物敏感性的关系需要进一步探索。 另外，从本质上讲，化疗药物杀灭肿瘤细胞的机制是控制其细胞周期、抑制细 胞增殖，并促进肿瘤细胞死亡。实际上包括紫杉醇在内的多数化疗药物均是细胞周 期的抑制剂，因此细胞周期信号通路在肿瘤细胞产生耐药性过程中可能起重要作用。 细胞周期功能基因芯片的出现为全面研究耐药肿瘤的细胞周期信号途径提供了快 速、可靠的高针对性手段。 本研究首先以人卵巢癌细胞系SKOV3为亲本细胞，用中等剂量间歇作用结合低剂 量持续作用法诱导建立耐紫杉醇细胞模型，并观察P—gp表达和B微管蛋白亚型改变 在卵巢癌细胞获得紫杉醇耐药性过程中的作用；在此基础上，着重研究耐紫杉醇细 胞亚系的纺锤体检查点功能状态及其主要组分Mad2和BubRl蛋白的表达水平；最后利 用功能基因芯片技术比较耐紫杉醇细胞亚系及其亲本细胞系的细胞周期调控基因表 达差异，以寻找新的耐药相关基因。旨在阐明卵巢癌细胞对紫杉醇发生获得性耐药 的分子机制，为克服肿瘤耐药提供新的理论依据。 浙江大学博士学位论文第一部分 浙江大学博士学位论文 第一部分 耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系SKOV3一TR30的建立及特征 研究目的 建立稳定、可靠的耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系，为紫杉醇耐药机制的研 究提供实