tnfα对肾间质纤维化细胞表型变化的作用及补肾活血法中药对肾小管上皮细胞转分化的抑制作用病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

中文摘要TNF．仅对肾间质纤维化细胞表型变化的作用及补肾活血法中药 中文摘要 TNF．仅对肾间质纤维化细胞表型变化的作用及补肾活血法中药 对肾小管上皮细胞转分化的抑制作用 摘 要 目的：肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各种肾病的终 末期共同表现，与慢性肾功能衰竭密切相关，其主要病理变化是肾小管上 皮细胞的减少，细胞外基质积聚，以及一定阶段内间质中出现较多的肌成 纤维细胞(Myofibroblast，MyoF)，肌成纤维细胞参与肾问质纤维化的形 成过程。近来的研究认为间质中出现的MyoF除来源于成纤维细胞的活化 外，部分来源于小管上皮细胞的转分化。小管上皮细胞转分化为肌成纤维 细胞(tubular epithelial．myofibroblast trails—diffentiation，TEMT)可能是 进展性肾脏疾病发生间质纤维化的重要机制之一。马兜铃酸(aristolochic acid，AA)是马兜铃属植物的主要成分，可以直接损害肾小管上皮细胞， 使其发生转分化、坏死或凋亡等，导致肾间质纤维化。最近有研究报告马 兜铃酸诱导肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化可能是肾间质纤维化的 主要原因。已有的研究发现转化生长因子一B(transforming growth factor-I]， TGF．B)和b成纤维细胞生长因子(b—fibroblast growth factor，bFGF)能 单独诱导小管细胞的转分化，但其它细胞因子的作用尚不清楚，且TGF．6 是TEMT最强有力的诱导剂，关于肿瘤坏死因子一a(tumor necrosis factor．a，TNF一旺)在肾小管上皮细胞转分化作用的研究尚未见报告。探讨 TNF—c‘在TEMT的作用，对认识肾间质纤维化的机制很有帮助。目前， 西药如黏附分子等防治RIF还处于实验阶段，尚未应用于临床。而中药抗 RIF的研究尚处于起步阶段，仅对少数中药及其提取物有较深入的研究， 而对中药复方的研究甚少，且缺少系统深入的作用机制研究。我们通过使 用不同浓度的rn师一a刺激体外培养的肾小管上皮细胞，并与TGF一13联合 作用，以观察TNF-n在肾小管上皮细胞转分化和肾间质纤维化进展中的 作用，探讨n师．I／,能否诱导人肾小管上皮细胞(human kidney cell，HKC) 细胞发生表型变化：此外通过给予大鼠腹膜内注射纯品马兜铃酸，诱发肾 间质纤维化，观察小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞在纤维化过程中的 作用，以及n虾一0【在转分化过程中的表达；通过单侧输尿管结扎术 ±圭塑墨——— (unilateral Ureteral Obstruction，UUO)造模，应用补肾活血法中药复方 治步Y／fffnq质纤维化，探讨该中药组方对肾间质纤维化的防治作用。 方法：第一部分，选择HKC细胞为研究对象，分为4组：(1)阴性对 照组；(2)TGF．B(8ng／m1)阳性对照组；(3)n师·旺各浓度组(1，5， 50，100ng／m1)；(4)TGF．13+TNF—d联合用药组：TNF—c【(50ng／m1)+TGF。13 (8ng／m1)、n盯．a(100ng／m1)+TGF．13(8ng／m1)。应用形态学、间接免 疫荧光法，免疫组化双染技术和酶联免疫吸附法观察各组HKC细胞发生 表型变化和细胞外基质的形成情况。 第二部分，选择Wister大鼠，随机分为二组，A组；马兜铃酸实验组 (n=30)，给予腹膜内注射马兜铃酸，剂量为5mg·kgld～，共给药16周， 16周后停药观察，在用药后8、12、16、20、24周分别处死6只大鼠。B 组：正常对照组(n=6)：给予腹膜内注射生理盐水每只2ml：d～，共16周。 通过血、尿生化检测、光镜观察及体视学测量、免疫组化检测、细胞总 RNA的提取及电泳鉴定等方法观察马兜铃酸诱发小管上皮细胞转分化为 肌成纤维细胞在肾间质纤维化过程中的作用，以及TNF．Ⅱ在转分化过程 中有无特异性表达。 第三部分，选择Wister大鼠32只，对照组8只，仅行假手术，其余 24只在无菌条件下行单侧输尿管结扎术诱发肾间质纤维化模型，术后随 机分成治疗组和模型组，治疗组于UUO手术第一天起给中药，根据动物 体重，高、低两个剂量灌胃，分别是4．09·kg‘·d．1和2．09·kg‘1·d一， 每一剂量8只动物，模型组8只动物予等量温水。通过免疫组化检测肾小 管组织波形蛋白(vimentin，Vim)、角蛋白(cytoketatin，CK)以及0【一 平滑肌肌动蛋白(0【．smooth muscle actin，a．SMA)的表达，并定量分析 。肾小管上皮细胞内免疫组化阳性面积和肾小管上皮细胞总面积的比值，取 其平均值为每例标