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大豆疫霉菌基园芯片检测技术研究摘要 大豆疫霉菌基园芯片检测技术研究 摘要 大豆疫病(Phytophthora so如P)是严重危害大豆生产的毁灭性病害。该病1948年首 先在美国发现，目前已传播至数十个国家，广泛分布于世界上火部分大豆产区，每年对全 球的大豆产业造成的损失高达10亿美元。近年，大豆已经成为我国进口量摄火的农产品． 我图每年进口大豆1000～2000万吨，金额达数十亿美元，几乎相当于我国人豆的产鼙。其 中进口盈最高的国家是美嗣，其次是阿根廷和巴西。我国自1986年起：瞎大豆疫病列为对外 检疫对象。 本研究应用基因芯片这～高通量检测技术对大豆疫霉菌及其相关种，包括：烟草疫霉 (Phytophthora nicotianae)、辣椒疫霉(Phytophthora eapsicf)、苎麻疫霉 (PhytophthoTa bochmeniae)、寄生疫霉(Phytophthora parasf“ca)、大豆霜霉 (Peronospora manschUTiCa)、大雄疫霉(册tophthora megasperm8)、瓜果腐霉(厅thium aphaniderma rum)、群结腐霉(办thJam myrdothlum)、侧雄腐霉(毋thdum paToecandrum) 共10个种27个菌株开展了研究。 在研究中，通过对大豆疫霉菌及其相关种DNA序列的查找、比较与分析：进而对大豆 疫霉菌及其相关种通用引物、大豆疫霉菌特异性探计及大豆疫霉菌及其相关种通媚探钟进 行设计与合成．在此基础上，制备了大豆疫霉菌检测基因芯片。在大豆疫霉茁基因芯片的 检测中．对大豆疫霉菌及其相关种通用引物应用单重PCR、双重PCR、三重PCR进行筛选， 并进行了反应体系的优化；在基因芯片杂交前，进行了基因芯片杂交条件的筛选：廊州筛 选出的三重PCR体系对大豆疫霉菌及其相关种进行扩增，在优化后的杂交条件下进彳亍了人 豆疫霉菌特异性探针和大豆疫霉翦及其相关种通用探针的特异性和稳定性实验；大豆痰霉 菌及其相关种基因芯片检测技术的灵敏度实验及单个孢予基因芯片检测实验。 通过研究，自行设计和合成了大豆疫霉菌基因芯片检测探针44条、引物10对，从中广泛筛选 出大豆疫霉菌捡测特异性探针7条．大豆疫霉菌及其相关种检测通用探针2条，通用引物3对。首 次建立了大豆疫霉菌基因芯片检测的三重PCR体系．和相应的检测程序。优化出大豆疫霉苗基因 芯片检测杂交温度和杂交液．最佳温度为42℃．最适杂交液的配方为：5×SSPE、2％SDS。 在此基础上，首次建立了大豆疫霉菌基因芯片检测方法。该方法特异性强。所制备的芯片 能特异性地检测大豆疫霉菌；灵敏度高，为达0．2pg／pL,低通量．能对大豆疫霉菌不同萋 囡的多个物种特异性DNA片断或多个碱基位点进行一次性同时检测；能对大豆疫霉与其他 菌在一些DNA片断中仅存在单个碱基差别的检测。本研究还对大豆疫霉菌单个卵孢子基圜 芯片捡测方法进行了探索研究，初步建立了单个卵孢子基因芯片检测方法，使国境口岸在 截获一个至少量卵孢子的情况下．也能开展对大豆疫霉菌的检测。 本研究所建立的大豆疫霉菌基因芯片检测方法与传统土壤诱集所进行的形态学鉴定方 法相比。检测时间明显缩短，从25天左右，缩短至一周。如从土壤中直接发现卵孢子，则 可缩短至2-3天；与常规PCR方法相比，该方法灵敏度更高；与实时荧光PCR方法相比， 同时检测的目标DNA片段更多，结果更可靠．而单个卵孢予检测方法适合于口岸截获少量 孢子时使用。大豆疫霉菌的基因芯片检测方法无论在田间还是在固境口岸对大豆疫病菌的 检测均具有推广应用价值．该方法也为搭建疫霉属真菌基因芯片检测平台方法的建立奠定 了基础。 关键词：大豆疫霉菌 基因芯片 检测 4 贵州大学2005届硕士研究生学位论文Abstract 贵州大学2005届硕士研究生学位论文 Abstract 脚tophthora sojae is a destructive disease and it is becoming a major threat to soybean production．111e disease was first found in America in l 948．and it has distributed in most of soybean regions of the world by now,which counts for a lOSS of about a billion of dollars to the soybean industry of the world every year．Recently,the import quantity of soybean is ahnost 10 t