促treg细胞生成活化的重组分子pctl的体外功能验证内科学血液病专业论文.docxVIP

徐州医学院硕士学位论文KD 徐州医学院硕士学位论文 KD kilodolton 千道尔顿 His Histidine 组氨酸 IL interleukin 白细胞介素 IPTG isopropylthio·-D·-galactoside 异丙基．p．D-硫代半糖苷 LB Luria-Bertani culture medium LB培养基 NC nitrocellulose filter membrane 硝酸素纤维膜 ， ，▲ OD optical density 光密度值 PAGE polacrylamin gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链反应 pH hydrogen ion concentration 氢离子浓度指数 噜． PMSF phenylmethanesulfonyl fluoride 苯甲基磺酰氟 印m Revolutions per minute 每分钟转速 峰 RNA ribonucletic acid 核糖核酸 SDS sodium dodecyl sulphate 十二烷基磺酸钠 TBE tris．buffered saline Tris缓冲液 TEMED N,N,N’，N’．Tetramethylethylenediamine N,N,N’N’一四甲基乙二胺 TGF-D transforming growth factor-13 转化生长因子-p Treg regulatory T cells 调节性T细胞 2 徐州医学院硕士学位论文促Treg细胞生成、活化的重组蛋白pCTL的体外功能 徐州医学院硕士学位论文 促Treg细胞生成、活化的重组蛋白pCTL的体外功能 验证 中文摘要 目的FOXP3+CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)主要在机体免疫调节中发挥 负向调节作用，可诱导机体产生免疫耐受。然而，机体内此细胞数量较少。本实 验旨在通过原核表达获得促Treg细胞生成、活化的重组分子pCTL和pC2一C4，并 于体外验证两蛋白诱导Treg细胞生成及活化的功能。 方法 1．重组蛋白pCTL及pC2．C4的表达、纯化及复性：将构建正确的重组 质粒pET28a-C2-C4-L-hmTGF-[31及pET28a-C2一C4转化大肠杆菌感受态细胞 BL21(DE3)，使用IPTG诱导蛋白表达，超声破碎细菌，包涵体洗涤及镍亲和层析 法纯化目的蛋白，透析复性方式复性纯化后蛋白；复性后重组蛋白pCTL与人舌鳞 癌细胞Tea8113共培养以验证蛋白活性。2．重组蛋白pCTL体外促Naive T细胞 Treg化的作用分析：将pCTL作用于新鲜分离纯化的人外周血淋巴细胞，以流式 细胞术检测作用后CD4+CD25+T细胞的比率的变化；pCTL与CD3单抗(OKT3) 共刺激淋巴细胞，使用荧光定量PCR及Western blot方法分别检测Treg细胞特异 性转录因子FOXP3 mRNA及FOXP3蛋白的表达情况；同时以MTT方法检测不同 时间、不同浓度的pCTL对淋巴细胞细胞增殖反应的抑制作用。3．重组蛋白 pC2一C4体外作用初探：复性后pC2．C4蛋白与OKT3共培养，以MTT方法检测不 同时间、不同浓度的pC2．C4对淋巴细胞增殖反应的抑制作用；同时以荧光定量 PCR及Western blot方法分别检测Treg细胞特异性转录因子FOXP3 mRNA及 FOXP3蛋白的表达情况。 结果1．成功获得以包涵体形式表达的重组蛋白pCTL及pC2．C4，经纯化后 蛋白纯度95％，复性后重组蛋白pCTL可以抑制Tca8113细胞的增殖。2．重组蛋 3 徐州医学院硕士学位论文 徐州医学院硕士学位论文 白作用于淋巴细胞后CD4+CD25+Treg细胞的比例较对照组增高；FOXP3 mRNA及 FOXP3蛋白的表达量均增高；pCTL可抑制淋巴细胞的增殖，随着时间的延长及 蛋白浓度的降低对细胞增殖的抑制作用减轻。3．重组蛋白pC2．C4可与CD4+T淋 巴细胞特异性结合；抑制淋巴细胞增殖反应；并且可增加活化后淋巴细胞的FOXP3 mRNA及FOXP3蛋白的表达量。pC2．C4与pTGF．B1共作用，可抑制淋巴细胞的 增殖，作用强度与pCTL无明显差异；pC2．C4与TGF．B1蛋白作用的先后顺序不 同，对淋巴细胞增殖反应的抑制情况不同，TGF．Dl作用在先时抑制作用较强。 结论 1．成功获得高纯度的有活性的重组蛋白pCTL及pC2．C4。2．在体外重 组蛋白可升高CD4+CD25hiTreg细胞的比例，促进Naive T细胞向Treg细胞转化， 可增强Treg