cd151促细胞迁移血管形成及大鼠缺血后肢血运重建内科学心血管专业论文.docxVIP

华中科拄大学同济医学院博士学位论文 华中科拄大学同济医学院博士学位论文 中文摘要 研究方法 首先通过PCR方法将CDl51基因末端连接HA尾(HAtag)，通过更换引物的酶 切位点将其分别呈正向和反向克隆到双链腺相关病毒表达载体上(dsAAV)。将其与 重组腺相关病毒包装质粒pXX2和辅助质粒pXX6按摩尔比1：l：1的比例，通过磷 酸钙沉淀法共转染293细胞，包装制备rAAV-CDl51．HA和rAAV-antiCDl51，用斑 点杂交法测定病毒的浈度。将获得的病毒转染Tca81 13细胞，经Western blot检{贝|i CDl51蛋白质的表达时间梯度，观察转染rAAV-CDl51-HA和rAAV-antiCDl5l后 CDl51蛋白质表达的交化，同时确定最佳的表达对问。 然后将构建的含有正义和反义CDl51基因的重组腺相关病毒分别转染舌鳞癌 细胞Tea81 13和内皮细胞株ECV304。通过Boyden小室培养和划痕修复实验观察 CDl5l的表达对这两种细胞的定向迁移和非定向迁移能力的影响。将转染后的 ECV304细胞种植在Matrigel上，观察其条索状微血管结构的形成情况。 最后将Wistar大鼠共12只，随机分为实验组和对照组，每组各6只。实验组 大鼠右侧后肢肌肉注射局部转染rAAV-CDl5l，对照组大鼠注射rAAV-GFP(1× i010P fuf只)。基圉转染2周后行股动脉切除术建立右侧大鼠后肢缺盘模型。通过 大鼠损伤评分、后肢皮肤温度测定、后肢动脉造影和缺血肌肉组织毛细血管密度 检测，观察缺血肢体血管再生和评价皿运重建情况。阁RT．PCR、Western blot和 免疫组化方法检测两组火鼠局部缺血肢体CDl5l的表达。 实验结果 成功包装了携带有目的基因的重组腺相关病毒rAAV-CDl51．HA和 rAAV-muiCDl 51，并获得了足够实现生理表达量的病毒滴度(2×lO“pfu／ml和1 ×1011p n1．／m1)。 ：]寄rAAV-CDl51-HA和rAAV-antiCDl51分别转染7fca8113细胞NIECV304细胞，通 ．过2Boydan-J、室培养和划痕修复试验证实rAAV-CDl51．HA能够增强这两种细胞的表 迭，而转染rAAV-antiCDl51抑制细胞CDl5l的表达后，这两种细胞的迁移能力均显 著下降。此外高表达CDl51的EcV304细胞在Matrigel形成条索状结构，并相H连接 形成毛细血管网络。而转染rAAV-antiCDl51阻断CDl5l表达后EcV304细胞聚集成团 状。这表明CDI 51能够有效地促进细胞迁移和体外虹管形成。 华中科技大学同济医学院博士学位论文 华中科技大学同济医学院博士学位论文 中文摘要 rAAV-CDl51-HA经肌肉注射转染大鼠后肢缺直模型后，能有效促进转染局部肌 肉组织CDl5l的表达，且未见异位表达。转染rAAV-CDl51．HA的实验组大鼠缺血 后肢功能恢复优于对照组：局部皮肤温度较对照组高1．7C(P(O．05)，与对侧正常 肢体皮肤温度差异无显著意义；后肢血管造影结果显示实验组缺血侧血管评分明显 高于对照组，分另4为2 56±0．37和1 57+0．39；实验组缺血后肢肌肉组织毛细血管 密度也明显较对照组高，分别为(6094-83，89)／rnm2和(5074-70．65)／mm2，两 组比较均有显著性差异(尸0．05)。 实验结论 经本研究证实： @rAAV-CDl51．HA能增强体外培养细胞CDl51的表达，有效促进筇{胞迁移和体 外血管形成； ②rAAV-antiCDl5l能明显阻断体外培养细胞CDl51表达，抑制细胞的迁移和体 外血管的形成； ③腺相关病毒介导的CDl5 l基因能够在机体内稳定而有效的表达： @rAAV-CDl51能够显著提高局部缺血组织的血管再生能力，促进缺血肢体功 能的恢复。CDl5l将成为血管再生治疗的新的备选基因。这一研究结果有利于将 各种促血管生成因予合理联用，使生物治疗更加合理有效。 关键词：CDl51；rAAV；细胞迁移；血管形成：血运重建；后肢缺血 3 华中科拄大学同济医学院博士学位论文 华中科拄大学同济医学院博士学位论文 英文摘要 CDI 51 Promotes Cell Migration and Neovascularization， Improves Blood Perfusion in Rat Model of Hind-Limb Ischemia Division of Cardiology