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To¨样受体信号对角膜天然免疫影响的实验研究 To¨样受体信号对角膜天然免疫影响的实验研究 浙江人学博i：学位论文2007 Toll样受体信号对角膜天然免疫影响的实验研究 浙江大学医学院：眼科学 博士研究生：晋秀明 导师：瞿佳教授 中文摘要 第一部分 糖皮质激素对角膜上皮细胞和角膜成纤维细胞TLRs的表达和功能 的调控 目的：评估糖皮质激素对人角膜上皮细胞和角膜成纤维细胞的Toll释受体 (Toll—like receptors，TLRs)表达和功能的影响。 方法：使用三种不同浓度的氢化可的松(1，10，100pg／m1)去刺激培养的 人角膜上皮细胞系和角膜成纤维细胞，用RT-PCR和Real—time PCR来检查 TLRI．10的mRNA的表达，以及这种表达在不同浓度氢化可的松干预下的变化 情况。用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)来检 测两种培养细胞在正常状态下和氢化可的松干预下的IL．6，8的释放。TLR2，3， 4，9蛋白水平的表达使用荧光免疫组织化学和western blot来检测。 结果：人角膜上皮细胞系和角膜成纤维细胞均表达TLRl．10 mRNA，但是两 种细胞表达的TLRs的量存在差异性，其中人角膜上皮细胞系TLRl，3，4高表 达，TLR7，8，9，10低表达；而在人角膜成纤维细胞TLR4高度表达，TLR7， 8，9，10，2表达量相当低。在氢化可的松的干预下这两种细胞表达TLRs明显 本课题受浙江省自然科学基会资助：项目编号：Y205672 2 里!壁兰竺笪!翌鱼堕丕鉴墨堡墅堕竺兰竺里鍪 里!壁兰竺笪!翌鱼堕丕鉴墨堡墅堕竺兰竺里鍪 塑垩盔兰堡主兰堡堡苎!塑： 不同，在人角膜上皮细胞系氢化可的松能促进大多数TLRs mRNA的表达，特别 是TLR2，3，4，9；而在人角膜成纤维细胞却表现为明显抑制TLRs mRNA的表 达。荧光免疫组织化学和western blot也表明氢化可的松能促进入角膜上皮细胞 系TLR2，3，4，9在蛋白水平的表达，但是在人角膜成纤维细胞却表现为抑制 TLR2，3，4，9在蛋白水平的表达。ELISA结果表明氢化可的松能促进人角膜 上皮细胞系IL．6在培养液中的释放，同时抑制IL．8的释放：而在人角膜成纤维 细胞ID6，8均表现为明显的抑制。 结论：TLRl—10在人角膜上皮细胞系和角膜成纤维细胞均有表达，不同TLRs 受体在同一细胞表达量不同，而各受体在不同细胞的表达也不同；氢化可的松能 调控人角膜上皮细胞系和角膜成纤维细胞TLRs在mRNA和蛋白水平的表达，也 能调控TLRs下游细胞因子IL-6，8的释放，但是对人角膜上皮细胞系TLRs表现为 轻度促进，而对角膜成纤维细胞TLRs表现为抑制，提示了角膜的这两种细胞在 角膜天然免疫和角膜炎症过程中发挥不同的作用；氢化可的松促进人角膜上皮细 胞系TLRs的表达和功能暗示了糖皮质激素在天然免疫方面的一个新的功能，提 示糖皮质激素在角膜不同细胞发挥不同的免疫作用，其中对角膜上皮可能具有免 疫增强功能，因此局部使用糖皮质激素在角膜上皮完整时可能有降低角膜机会性 感染韵可能，也可能会有益于某些特定的角膜感染，研究结果为糖皮质激素在临 床合理应用提供了新的依据。 关键词：Toll样受体；氢化可的松；天然免疫；角膜上皮细胞系；角膜成纤 维细胞；细胞因子 第二部分 茄病镰刀菌灭活菌丝对角膜上皮细胞TLRs的表达和功能的影响 目的：通过研究人角膜上皮细胞系在接受灭活的茄病镰刀菌菌丝刺激后Toll 样受体(toll—like recel3toi$，TLRs)的表达和功能变化，探讨角膜上皮及其表达的 TLRs在角膜真菌感染中的作用 方法：茄病镰刀菌的灭活菌丝片断按照l：l比例来刺激培养的角膜上皮细胞 系，细胞的TLRl．10 mRNA表达用Real．time PCR来分析，用ELISA来检测培 3 旦!!堂墨堡生!翌垄堕墨鳖墨堡堑堕堕壅丝!!塑 旦!!堂墨堡生!翌垄堕墨鳖墨堡堑堕堕壅丝!!塑 塑垩查兰苎!：竺丝丝兰!塑! 养液中的细胞因子IL-6，8；然后10#ggml的氢化可的松被用来和灭活菌丝～起 来刺激培养的细胞，再次分析TLRl—10 mRNA的表达和IL6，8释放； TU也， 4蛋白水平表达的变化用荧光免疫组织化学和westernblot进行检查。另外用 TLR2，4的单克隆抗体来阻断TLR2，4观察菌丝对IL．6，8释放的影响。 结果：茄病镰刀菌的灭活菌丝能增加上皮细胞TLR2，3，4，6 mRNAs的表达 和IL．6，8的释放，糖皮质激素能轻度增加角膜上皮细胞TLR2和TLR4的表达 和11．-6的释放。荧光免疫组织化学和western blot结