促酰化蛋白诱导前脂肪细胞的分化研究及脂源性激素变化的临床意义研究儿科学专业论文.docxVIP

华中科技大学同济医学院200l级博士学位论文基础实验部分： 华中科技大学同济医学院200l级博士学位论文 基础实验部分： ASP诱导前脂肪细胞分化的作用及分子机制研究 华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科 研究生： 卢慧玲 导师： 林汉华教授 中文摘要 目的 研究促酰化蛋白(ASP，Acylation Stimulating Protein)诱导前脂肪 细胞分化的作用及机制。观察ASP诱导前脂肪细胞(Preadipocytes)分化过 程中的形态学变化，测定分化过程中甘油三酯(Triglyceride，TG)合成及在 分化细胞中的累积情况；观察分化过程中前脂肪细胞的克隆增殖；检测ASP 诱导脂肪细胞过程中特异性分化转录因子过氧化物酶体增殖物活化受体Y、 CCAAT／增强子结合蛋白q和CCAAT／增强子结合蛋白6 mRNA表达水平及时序 性变化；并观察脂肪细胞特异性功能蛋白脂蛋白脂酶、二酰基甘油转酰酶和 脂素的表达规律：分析ASP诱导分化过程中脂肪细胞基因表达谱的改变，筛 选与分化相关的基因，从而探讨ASP诱导前脂肪细胞分化的分子生物学机制。 以期进一步深化生命科学界对ASP这一调控脂肪代谢的新型激素的认识，从 新的研究领域认识脂肪细胞分化的分子机制，并为肥胖症和胰岛素抵抗的防 治开拓新思路。 华中科技大学同济医学院2001级博士学位论文方法 华中科技大学同济医学院2001级博士学位论文 方法 1、采用激素鸡尾酒法(50 ug／ml ASP+0，5mM 1。甲基．3一异丁基黄噤吟+1．OuM 地塞米松)诱导3T3一L1 HO Hc,肪细胞分化，采用光学显微镜观察3T3一L1前脂 肪细胞的形态学变化及细胞内脂滴的形成。 2、采用油红染色的方法，评价ASP诱导前脂肪细胞分化的百分率。 3、采用3H一油酸(3H—oleic)掺入法测定ASP诱导前脂肪细胞分化过程中脂 肪细胞甘油三酯的合成率(Triglyceride Synthesis，TGS)，并用化学比色法测 定脂肪细胞中甘油三酯的总量(TG mass accumulation，TGM)。 4、采用3H胸腺嘧啶(3H．thymidine)掺入法、四氮唑蓝法(MTT)和流式 细胞术检测ASP诱导3T3一L1前脂肪细胞分化过程中DNA的合成率、细胞增殖 情况和细胞周期的构成，评价分化过程中细胞的克隆增殖状态。 5、采用RT—PCR方法，检测ASP诱导前脂肪细胞分化过程中转录因子 PPAR Y、C／EBP 6、C／EBPt￡mRNA表达的强度及时序性；检测脂肪细胞特异性 功能蛋白脂蛋白脂酶、二酰基甘油转酰酶和脂素表达的强度及时序性。 6、采用表达谱芯片，检测ASP诱导前脂肪细胞分化不同时间点，基因表 达谱的变化，筛选与分化相关的基因。 结果 一1、ASP组诱导分化第4d，3T3一L1前脂肪细胞变大、变圆，胞浆中出现脂 滴；诱导分化第6d，细胞进一步变大、变圆，脂滴明显增多，从形态上由前 脂肪细胞向成熟脂肪细胞转变；诱导分化第8d，大多数细胞分化成熟。ASP 诱导脂肪细胞分化的分化率很高(85％)，与经典的“鸡尾酒”激素诱导分化 法的分化率(90％)相似，显著高于IBMX+DEX组诱导分化的分化率。 2、诱导分化第3d时，ASP组脂肪细胞的甘油三酯合成率明显升高，与 对照组和IBMX+DEX组相比差异有显著性(P0．01，PO．05)，但仍低于经 华中科技大学同济医学院2001级博士学位论文典刺激组，(PO．05)：在分化第6d和第9d时，甘油三酯合成率进一步升高， 华中科技大学同济医学院2001级博士学位论文 典刺激组，(PO．05)：在分化第6d和第9d时，甘油三酯合成率进一步升高， 与对照组和IBMX+DEX组相比差异有极显著性(P0．01，PO．叭)，与经典 刺激组相比无显著性差异(P0．05)。 在诱导分化3d时，ASP组脂肪细胞的甘油三酯总量升高，与对照组和 IBMX+DEX组相比差异有显著性(PO．05)；到分化6d和9d时，甘油三酯总 量进一步升高，与对照组和IBMX+DEX组相比差异有极显著性(P0．01)， 而与经典刺激组相比无显著性差异(P0 05)。 3、ASP组在诱导分化24h时，DNA合成率明显增加，与对照组相比差异 有显著性(P(0．01)，在48h和72h时DNA合成率有降低，与对照组相比差异 无显著性(乃O．05)。诱导分化24h时，ASP组细胞增殖明显，与对照组相比 差异有显著性(P(0．05)：诱导分化48h时，ASP组和胰岛素组的细胞增殖均 不明显；诱导分化72h时，ASP组细胞无明显增殖，但胰岛素组细胞增殖明显， 与对照组相比差异有显著性(P(0．05)。汇合后的细胞，阻滞于G。／G：期，处于 相对生长停滞的状态：ASP组诱导分化24h时