茎环法对转ZmC1基因丹参毛状根中microRNA表达.pdfVIP

·８２· ＡＣＴＡＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＴＩＳＴＲＡＤＩＴＩＯＮＩＳＭＥＤＩＣＡＬＩＳＳＩＮＥＮＳＩＳＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＡＥＱＵＥＳＨＡＮＧＨＡＩＶｏｌ．３０Ｎｏ．２Ｍａｒ．，２０１６ 方药研究 ＤＯＩ：１０．１６３０６／ｊ．１００８８６１ｘ．２０１６．０２．０１９ 茎环法对转ＺｍＣ１基因丹参毛状根中 ｍｉｃｒｏＲＮＡ表达分析 郑小宇，赵淑娟 上海中医药大学中药研究所　（上海　２０１２０３） 【摘　要】　 目的：对转 ＺｍＣ１基因丹参毛状根 Ｃ１３株系中８个 ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ），即 ｍｉＲ１６４ｂ、 ｍｉＲ１６６ａ、ｍｉＲ１６６ｂ、ｍｉＲ１７１ａ、ｍｉＲ１７１ｂ、ｍｉＲ１７２、ｍｉＲ３９４和ｍｉＲ３９７进行表达定量分析。方法：以野生型丹参 毛状根为对照，采用茎环法（Ｓｔｅｍｌｏｏｐ），针对每个ｍｉＲＮＡ设计３条引物，包括一条特异性反转录引物、一条 上游引物和一条通用反向引物。每个ｍｉＲＮＡ单独反转录，实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）检测转基因丹参毛 状根Ｃ１３中８个ｍｉＲＮＡ的表达，实验数据用 Ｃｔ法进行分析。结果：与野生型丹参毛状根相比，在转基 ΔΔ 因毛状根Ｃ１３中８个ｍｉＲＮＡ均表现为不同程度的上调，其中ｍｉＲ３９４、ｍｉＲ３９７和ｍｉＲ１６４最为显著，分别为 对照的１５．１４倍、７．３１倍和４．８２倍。结论：茎环法可以成功应用于检测丹参中ｍｉＲＮＡ的表达；Ｃ１３中这 几个ｍｉＲＮＡ转录水平上调可能与ＺｍＣ１异源表达引起的有效成分含量及形态发育表型变化相关。 【关键词】　茎环法；转ＺｍＣ１基因；丹参毛状根；ｍｉＲＮＡ；表达分析；实时荧光定量ＰＣＲ 　　ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ）是一类真核细胞中广泛 ［１］ １　 材料与方法 存在的内源性非编码小ＲＮＡ 。成熟ｍｉＲＮＡ通过 与靶基因互补配对引起靶基因的降解或者抑制其 １．１　 植物　丹参毛状根诱导所用丹参无菌苗由采 翻译来调节靶基因的表达水平， ｍｉＲＮＡ是基因表达 自天目山的野生丹参培养而来。转基因丹参毛状 ［２］ 的重要调控分子 ，在植物的生长发育、激素信号 根Ｃ１３株系由带有ｐＣＡＭＢＩＡＺｍＣ１表达载体的农 转导、应激反应和次生代谢等方面都起着不可替代 杆菌ＬＡＢ９４０２转化丹参无菌苗叶片获得。野生型 ［３７］ 的调控作用 。 丹参毛状根作为对照材料，由发根农杆菌ＬＢＡ９４０２ 丹参（ＳａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａＢｕｎｇｅ）是唇形科鼠尾 ［１０］ 诱导获得。所有毛状根均采用常规方法 培养于 草属多年生草本，是大宗常用中药。丹参饮片及丹 本实验室。 ［８］ 参制剂是临床治疗心脑血管系统疾病的常用药 。 １．２　 试剂与仪器　ｍｉＲＣＵＲＹＴＭＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎ 近年来研究还发现复方丹参滴丸联合氨氯地平用 Ｋｉｔ，购自ＥＸＩＱＯＮ公司；ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ 药对高血压疗效显著，具有非常高的临床应用价 ｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ、ＳＹＢＲｐｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（ＴｌｉＲＮａｓｅＨ ［９］ 值 。我们在前期获得了有效成分含量及形态发 Ｐｌｕｓ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，均购自ＴａＫａＲａ公司（中国大连）。 育均发生了变化的转