大豆对大豆疫霉菌无毒基因Avr1b效应物蛋白的识别机制.PDFVIP

大豆对大豆疫霉菌无毒基因 Avr 1b效应物蛋白的识别机制  大豆对大豆疫霉菌无毒基因 Avr1b 效应物蛋白的识别机制 作者：刘秋萍 指导老师： 单卫星 摘 要：大豆疫霉和寄主大豆之间的互作遵循经典的基因对基因假说。许多大豆疫霉 无毒基因和大豆抗性基因都已得到鉴定，但已经克隆的很少。目前，对其编译蛋白与植物的 识别机制不是很清楚。本实验以最近分离得到的大豆疫霉无毒基因 Avr1b 为材料，通过构建 其植物表达载体和农杆菌介导的瞬时表达， 为分析病菌的 AVR 1b 效应物蛋白的毒性功能和 揭示寄主植物对效应物蛋白的识别机制奠定基础。 关键词：大豆疫霉；基因对基因假说；无毒基因；植物表达载体 前言:大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉(Phytophthora sojae )引起的一种大豆毁灭性病 [1] [2] 害之一 。1971年Flor提出 “基因对基因”假说 ，其基本观点可概括为:植物对大多数病 害的抗性取决于病原的无毒基因和植物的抗性基因;如果寄主带有抗性基因，病原带相对应 的无毒基因，病原繁殖就会受到抑制，植物表现抗病，在病原侵染位点形成局部过敏性坏死 反应;如果寄主的抗性基因及病原相对应的无毒基因，二者缺一，植物表现感病。大豆疫霉 [3]  和寄主植物大豆之间的互作也遵循这一假说。自Bernard  等鉴定出了第一个大疫霉根腐病 的抗病基因 Rps 1以来，目前已经在8个不同的位点上鉴定了  14个抗病基因。大豆疫霉菌中 [4]  [5]  也确定了11个无毒基因的地遗传定位  ，并且用图位克隆的方法已经分离得到Avrlb­1  。 1 材料和方法 1.1 材料 本实验 中使用大肠杆菌 （E.coli）的  DH10B  菌系，根癌农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens ）为GV3101，克隆载体为 pBluescript KS，植物表达载体为  CAMBIA1200。 大豆疫霉菌系 P7064 的基因组 DNA 由本实验室提供。凝胶回收和试剂盒，质粒微量回收试 剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司。PfuDNA 聚合酶、限制性内切酶 Hinc II、Xho I、Sca  I、EcoR I、T4 DNA 连接酶、CIP 脱磷酸酶购自 Fermentas 公司。所用 PCR 引物由上海生工 生物技术有限公司合成。 1.2 Avr1b 基因及其融合序列的获得和酶切 1.2.1 Avr1b 基因的获得 用 PCR 的方法，以提取的大豆疫霉菌 p7064 基因组为模板扩增出约 500bp 的 DNA 片断。 所用引物为 Avr1b_F2(ACTGAGTACTCCGAAACC)和 Avr1b_R1(CCCTCGAGATTTCGGCGAGACCTTCTC A)。PCR 反应条件：94 ℃ 2 min，30 个循环 （94 ℃30 sec， 60 ℃ 40 sec 和 72 ℃ 1 min） 然后 72 ℃ 10 min，最后冷却至 4 ℃。 DNA 样品在 1.2%的琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，电泳结束后，在紫外光下，用刀片切 下目的条带。再用凝胶回收试剂盒回收 DNA。 1.2.2 Avr1b 与大豆信号肽的融合 采用PCR 的方法用两段引物直接合成大豆的PR- 1a的信号肽序列模板。 引物为Soy_S_N1 （GAACCATGGGGTAC ATGTGCATTAAGATTTCGTTTTGTGTGATGTGTGTGTTGG）和 Soy_S_C1(GTAGGCAAC ATCACCCACGATCACCAACCCCAACACACACATCACA CAAAACG）。反应条件：94℃ 2 min，60 ℃ 1 min， 72 ℃ 10 min，最后使反应冷却至室温。 用引物 Soy_S_F1(GAACCATGGGGTACATGTGCAT)和 Soy_S_R1（GGTTTCGTCGGAGTACTCAGTGTA GGCAACATCACCCACGAT）合成大豆 PR­1a 的信号