医学分子生物学实验教程 主编覃扬.pdfVIP

在进行分子生物学的研究，开展基 因诊断、基 因治疗时，首先需要制备纯化高分子量 的 基因组 及 。提取核酸的样品来源不同和随后实验要求各异 ，以及技术的不断发展 ， 因而 ，提取纯化 的方法很多，需要根据具体情况加 以选择 。从细菌、植物和动 物细胞提取 或 一般包括两个步骤：首先要温和地裂解细胞 ，将 或 溶解 出来 （这一步因样 品的组织 、培养细胞系 、血液 的不 同，而方法有异 。）然后采取酶解或化 学方法，除去蛋 白质或其他大分子化合物后，再沉淀纯化 或 。从含有核酸的样品 溶液中分离沉淀核酸最常用又有效的方法是酚 ／氯仿抽提、乙醇沉淀法 。 酚 ／氯仿抽提 ，乙醇沉淀法 的基本原理 ：用酚和氯仿变性沉淀蛋 白质 ，使其漂浮在上层 水相与下层有机相 的交界面上 ，而核酸溶解在上层水相 中。所使用 的酚必须重蒸馏纯化及经 水饱和 以防止酚 中氧化物破坏核酸分子 。加入异戊醇可防止酚 氯仿抽提时产生大量的泡沫。 此有机抽提液配方是酚 ／氯仿 ／异戊醇（容积 比为 ／ ／ 。首选沉淀 的有机溶剂是 乙 醇 。在上述处理过 的无蛋 白质含核酸水相液 中加入 乙醇后 ，白色 的核酸沉淀很 易经离心收 集 。乙醇沉淀核酸 的优点是它与盐类 的共沉淀较少 ，而且 沉淀中所含 的痕量 乙醇易蒸 发去除，而不影响继后实验的进行 。在适当的盐浓度下 ， 倍容积的无水乙醇或 乙醇可 有效沉淀 ，对 的沉淀则需将 乙醇量增至 倍 。若样 品核酸浓度低且体积大，为 了不使离心时容积过大 ，可用异丙醇代替乙醇沉淀 。只需加入 ￣ 倍体积 的异丙 醇即可选择性沉淀 和大分子的 和 （但不沉淀 及 多 糖 ），其 缺点是易与盐共沉淀 ，所 以异丙醇沉淀后 ，应立即进行常规的乙醇沉淀 。 离子和温度会影响乙醇沉淀核酸 的效果 。核酸是多聚阴离子 的水溶性化合物 ，它与钠 、 钾 、镁等阳离子形成的盐在多种有机溶剂 中不溶解 ，也不被有机溶剂变性 。在核酸沉淀中使 用最多的是钾 、钠 、铵和锂等 价阳离子 ，而 价镁离子的沉淀效力最高 ，每一种离子 的选 用有各 自的优缺点和适用范围。常规沉淀核酸多采用 的乙酸钠 （终浓度）。 低温有助于 乙醇沉淀核酸 ，若溶液 中核酸浓度很高 （ ）时，不需任何冷却可形成 可见的沉淀 。若核酸浓度很低 （ ）则 需 在 （或在干冰上 ） ￣过夜 ，离心 分钟 ，才能获得沉淀 。或者加入酵母 以有效沉淀 级的核酸 ，加入 使 溶液中核酸浓度达到 后 ，再进行抽提和沉淀 ，但会干扰需用 多核苷酸激酶标记的 实验 。核酸浓度大于 时，冰浴 ￣ 分钟 即可有效沉淀 。 第 一节 从 哺乳动物 组织 中制 备基 因组 理论上可 以从哺乳动物的任何组织中提取基因组 ，但 是各组 织 中的 稳定性是 不 同的。稳定性 由高到低 的组织依次为肺 、肌 肉、皮肤 、淋 巴结、肾。虽然肝、脾 中 含量较高，但肝，脾中各种核酸酶活性很高，因此 极易分解 ，往往不易得到大分子量 的 。取材的组织要尽可能的新鲜，如不立即提取 应迅速置液氮 中冷冻或 ℃保 存 ，以备后用 。 实 验 一 从 哺 乳 动 物 组 织 中制 备 因组