假肥大型肌营养不良症基因缺失连接片段的克隆和应用-神经病学专业论文.docxVIP

硕士学位论文假肥大型肌营养不良症基因缺失 硕士学位论文 假肥大型肌营养不良症基因缺失 连接片段的克隆和应用 硕士研究生：钟敏 指导教师：陆兵勋潘速跃 摘要 背景和目的 假肥大型肌营养不良症(pseudohypertrophic muscular dystrophy，PMD)是 一种常见的致死性x-连锁隐性遗传病，病因主要是由于x染色体短臂2区1带 (Xp21)的基因突变而导致一种细胞骨架蛋白——抗肌萎缩蛋白(dystrophin) 的结构和功能异常所致。根据dystrophin空间结构改变和功能丧失程度不同， PMD可分为Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)和 Bcckcr型肌营养不良(Beckcr muscular dystrophy，BMD)两型，其中DMD是 最常见的类型，发病率约为1／3500活产男婴。 dystrophin基因全长超过2500kb，是迄今为止发现的人类最大基因，其突变 发生率高，形式多样。大片段基因缺失是dystrophin基因最常见的突变类型，约 占55～65％，是导致DMD／BMD的主要原因。dysffophin基因缺失的机制至今 仍未完全阐明，目前对dystrophin基因缺失机制的研究主要采用两种方法：一是 缺失断裂点分布特点的研究，二是缺失连接片段序列特点的研究。 由于分析dystrophin基因缺失连接片段的序列特点需要对其进行克隆和测 序，而dystrophin基因甚为庞大，～直以来克隆缺失连接片段的方法都很复杂， 因此目前有关缺失连接片段的序列资料比较缺乏，迄今国内外文献仅报告50余 例缺失连接片段的序列资料。试图以如此有限的资料阐述dystrophin基因缺失机 制无疑是困难的，当前研究者们仅有的共识是同源重组不是大多数dysuophin基 因缺失的原因，除此之外的各种假设往往互不相同甚至部分互相矛盾，具有很 大的争议。 摘要为了更多了解dystrophin基因缺失连接片段序列特点，我们的研究从克隆2 摘要 为了更多了解dystrophin基因缺失连接片段序列特点，我们的研究从克隆2 例DMD／BMD病例的缺失连接片段出发，在实验技术上在国内首次采用PCR步 移法对内含子上的断裂点进行定位，然后直接以PCR法扩增缺失连接片段。通 过采用分次PCR步移法，初步探讨在dystrophin基因大内含子上准确定位断裂 点的策略；通过对2例缺失连接片段的克隆和测序，探讨2例缺失连接片段断 裂点局部的分子结构特点；随后我们对这2例缺失连接片段和以往国内外文献 公开报道的55例有效缺失连接片段的序列资料进行综合分析，探讨重复序列、 基质附着区(matrixattachment regions，MARs)、TITAAA序列以及基因缺失后 修复方式等因素在dystrophin基因缺失中的作用，以深入阐述dystrophin基因缺 失的机制。 同时基于目前DMD，BMD的携带者检测和产前诊断技术尚不成熟，国内外 均未常规开展这方面的工作的现状，我们在进一步完成1个BMD家系中6例患 者／或携带者的基因缺失连接片段的克隆和测序分析后，对本项研究在携带者检 测和产前诊断上的应用价值进行了初步探讨。 材料和方法 1．定位dystrophin基因缺失断裂点的策略 选择2例临床证实的男性DMD／BMD患者(例1为DMD散发病例，例2 为一BMD家系先证者)，常规蛋白酶K和苯酚法抽提制备其外周血基因组DNA。 通过18+8对外显予引物PCR反应检测证实例1患者为dystrophin基因第45～54 外显子缺失，例2患者为第3～5外显子缺失。 2例5’端断裂点分别位于dystrophin基因庞大的第44和第2内含子，在以 上2个大内含子上先各设计5对引物将内含子序列人为地分成长度大致均等的6 个待查区域，经第一次PCR反应检测确认断裂点所在区域后继续在该区域每3kb 序列设计1对引物。2例3’端断裂点分别位于第54和第5内含子，引物设计为 直接每3kb序列设计1对引物。PCR步移法检测中若相邻2对内含子引物1对 扩增为正常阳性结果而另1对扩增为阴性结果，即可判断内含子上断裂点的近 似位置。 2．dystrophin基因缺失连接片段的克隆和测序 在对2例dystrophin基因缺失断裂点准确定位的基础上，分别在靠近例1患 者第44和第54内含子断裂点处和例2患者第2和第5内含子断裂点处各设计1 对配对引物，以直接对2例缺失连接片段进行长片段PCR扩增，扩增成功的PCR Ⅱ 硕士学位论文产物纯化后测序。 硕士学位论文 产物纯化后测序。 将所测序列和正常内含子序列进行对比，分析2例缺失连接片段5’端和3’ 端断裂点两侧各100bp序列的分子结构特点。内含子重复