剑尾鱼作为免疫评价模式动物的初步研究-临床兽医学专业论文.docxVIP

上海海洋大学硕士学位论文 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 ■ 姓名 工作单位 职称 备注 梁旭方 暨南大学 教授 主席 李安兴 中山大学 教授 委员 广东省水生动物疫病 陈文 研究员 委员 预防控制中心 广东省农科院兽医研 柯浩 研究员 委员 究所 中国水科院南海水产 王江勇 副研究员 委员 研究所 中国水科院珠江水产 任燕 助研 秘书 研究所 ● 中国水科院珠江水 答辩地点 答辩日期 2010一06．13 产研究所 上海海洋大学硕士学位论文剑尾鱼作为免疫评价模式动物的初步研究 上海海洋大学硕士学位论文 剑尾鱼作为免疫评价模式动物的初步研究 摘 要 实验动物遗传背景均一，用于实验重复性好，可比性强，正是用于食用或观 赏的鱼类所欠缺的，因此实验动物的重要性越来越被人们所认识，对实验动物的 ● 研究也越来越多。实验动物用于评价免疫因子方面的研究也逐年增加。 IgM存在于鱼的血清和其他分泌物中，包括皮肤和肠道粘液。不同种类的硬 骨鱼之间有不同的IgM的抗体反应和血清浓度。鲑鱼对许多抗原都有很高的反 应，产生与之相关的大量的特异性抗体，但这些反应都是由某些抗原表位调控。 相反，大西洋鳕鱼的一个特性是在半抗原疫苗或全菌疫苗免疫后其抗体水平完全 没有或只有微弱的提高，但是其免疫效果却较高。因此从基因水平研究IgM的表 达水平逐渐受到重视。在低等脊椎动物如鱼类，因为其特异性免疫系统不如高等 脊椎动物那样完善，因此非特异性的补体系统就占据了非常重要的地位。所以检 测非特异性指标也是评价疫苗效果的重要内容。 珠江水产研究所研究的剑尾鱼品系RR—B系已经具有较高的遗传纯度，符合 ◆ 作为水生实验动物的纯度要求。因此本论文以剑尾鱼作为研究对象，以嗜水气单 胞菌疫苗作为抗原，注射免疫后，应用荧光定量PCR技术探讨IgM mRNA在主要 免疫器官脾脏、头肾组织中表达水平的差异。因为剑尾鱼血清很少，不足以用来 检测；而之前很多文献都是以ELISA检测鱼类血清中的IgM抗体，所以为了研究 IgM在基因和蛋白水平表达的关系，本论文还以鲫鱼(Carassius auratus)作 为研究对象，也以嗜水气单胞菌疫苗作为抗原，注射免疫后，应用荧光定量PCR 技术探讨IgM mRNA在主要免疫器官脾脏、头肾组织中表达水平的差异，用ELISA 测定血清中抗体滴度变化，从基因表达和抗体产生水平上检测注射免疫产生的应 答效果。最后以剑尾鱼(Xiphophorus helleri)作为新的研究对象，同样注射免 疫嗜水气单胞菌疫苗，荧光定量PCR技术探讨非特异性免疫因子(补体Cl、C3、 C9)的消长规律。 l、鲫鱼注射嗜水气单胞菌灭活疫苗后IgM在基因和抗体水平的表达 鲫鱼注射嗜水气单胞菌疫苗后，定量PCR检测脾脏和头肾中IgM mRNA的转 录变化；同时用ELISA测定血清中抗体滴度变化。于免疫后定期取样，结果表明： 脾脏和头肾组织中均检测到IgM基因表达上调，并且随时间呈先升高后降低的趋 势。IgM在脾脏中有较大表达量(一免的高峰值在第4d，为18．91；二免的最高 上海海洋大学硕士学位论文峰是在第12d，为27．54)，而头肾中的表达量较小(一免的高峰值在第4d，为 上海海洋大学硕士学位论文 峰是在第12d，为27．54)，而头肾中的表达量较小(一免的高峰值在第4d，为 6．10；二免的最高峰是在第12d，为16．47)。而抗体滴度的峰值是在第22d，效 价为3200。比较鲫鱼血清的抗体与组织中基因的消长规律，发现组织中基因表 达的峰值出现时间较早(第12天)，上调持续时间较短(22d)。而抗体的出现滴 度最高峰与基因表达的最高峰相差一周左右，符合鱼类Ig产生的基本过程。 2、剑尾鱼注射嗜水气单胞菌灭活疫苗后IgM mRNA的表达 终浓度为108 CFU／mL的嗜水气单胞菌全菌疫苗注射免疫剑尾鱼后，应用荧光 定量PCR方法，研究免疫球蛋白IgM对嗜水气单胞菌疫苗产生免疫应答的作用效果 以及消长规律。结果表明，免疫后的剑尾鱼IgM在脾脏和头肾中都是在第4d到达 ● 高峰，分别为11．31和5．60。 3、剑尾鱼注射嗜水气单胞菌灭活疫苗后补体C1、C3、C9基因的表达 浓度为108 CFU／mL的嗜水气单胞菌全菌疫苗注射免疫剑尾鱼后，应用荧光定 量PCR方法，研究三种补体成分C1、C3、C9对嗜水气单胞菌疫苗产生免疫应答的 作用效果以及它们的消长规律。结果表明，免疫后的剑尾鱼C1在脾脏、头肾中表 达较低，与对照组相比变化不明显。而C3、C9的表达水平显著提高，C3、C9这两 个基因的表达似乎与合成的组织相关。在脾脏中，C3、C9的表达呈现一定的相似 性，都是在第2d达到最高峰，分别为16．32和10．82，而对照组在第6d也都有一个 小峰值(27．