兼性嗜热古地分枝杆菌燃料油脱有机硫研究-微生物学专业论文.docx

山东大学博士学位论文 中文摘要 二苯并噬盼(D ibe皿othiphene. DBT) 是化石燃料中含有的一种典型的有机 含硫化合物，使用传统的加氢脱硫 CHydrodesul 缸rization. HD8) 难以去除，因 此选择 DBT 作为微生物脱有机硫反应的模式化合物。使用微生物进行脱硫，有 两种途径:其中一种破坏有机硫的碳架，造成燃料热值损失:另一种，可以专一 作用于 DBT 的 C-8 键，不破坏碳架，不会降低燃料热值，具有商业化应用前景。 由于在 DBT 降解过程中涉及 4 个含硫化合物，所以称为 4S 途径(硫专一途 径)。本工作从炼油厂污水及土样中，筛选获得了一株能够在 45C 条件下生长的 菌株 X币，初步确定可以通过硫专一途径脱除 DBT 中的硫，产生 2-泾基联苯 (2-Hydroxybiphenyl. 2-HBP) 。菌株X7B 为短杆状，大小为 0.3-0.5 x 2.0-3.0 阳n; 革兰氏染色不易着色，通常为弱阳性:抗酸染色阳性，不运动，无泪子和英膜; 菌株细胞壁含有谷氨酸，丙氨酸和消旋二氨基庚二酸:主要的细胞壁糖为阿拉伯 糖，半乳糖:菌株 X7B 可以在麦康凯培养基生长，不生成结晶紫，并且能抗 5% NaCl; 168 rDNA 序列分析表明菌株和古地分枝杆菌 CMycobacterium goodii) 有 99%的相似性。根据上述结果. X7B 初步定为古地分枝杆菌。 初步研究了菌株在 450C 下生长脱硫情况。菌株可以在 16h 内将 0.25 mM DBT 完全降解，产生 0.2 mM的 2-HBP 。在50 h. 菌株可以将 0.4 mM DBT 降解 到 0.07 mM。此外菌株在不同温度下生长及脱硫情况的结果表明，古地分枝杆菌 X7B 可以在 30-50C 较宽的范围生长和脱硫，显示了较好的实际应用潜力。 通过 GC/M8. 检测了菌株代谢 DBT 产生的中间物及终产物，结果表明，菌 株代谢产生的终产物为二甲氧基联苯 C 2-Methoxybiphenyl. 2-MBP). 而并非以 前报道的包括红平红球菌 (Rhodococcus erythropolis) IGT88 在内的专一脱硫菌 株 4S 途径的终产物 2-HBP 。菌株X7B 降解 DBT. 检测到了中间产物 DBT 枫(DBT sulfone. 简称 DBT02 ) 的存在，而且也明显地检测到了 2-HBP. 只是 菌株能够进一步作用于 2-HBP. 将其控基甲基化，生成了 2-MBP ，检索文献表 明，这是第-株具有这种能力的菌株，因此，一扩展的 114S 途径也就确定了， 初步命名为 48M 途径。同时发现菌株 X7B 能够利用 DBT 炕经取代物为唯一 兼性嗜热亩地分校杆菌燃料油脱有机硫研究 硫源进行生长，如 4- 甲基 DBT C4-Me也yl-DBT ，4-M-DBT)和 4，6-二甲基 DBT (4，6-DimethylDBT ，4，6-DM-DBT) 。通过HPLC ，GC ，GCIMS 分析，菌株可以 降解 DBT 衍生物。菌株 X7B 代谢 4-M-DBT ，不仅4-M-DBT 的苯环加上了经基， 而且含有甲基取代的苯环也加上了起基。生成了 2- 起基 -3-甲基联苯 C 2-hydroxy-3 -methylbiphenyl) 和 2-经基-3- 甲基联苯.菌株降解含有甲基的 DBT.生成了含有甲基的 2-泾基联苯，说明菌株 X7B 可以专一性的作用于 4-M-DBT ，推测其途径基本符合14S 脱硫途径。 X7B 代谢 4，6-DM-DBT 的途 径也类似于 DBT 的降解，即得到的单涯基二甲基 DBT 的经基也被甲基化了，生 成了 2- 甲氧基-3，3-二甲基联苯 C 2-methoxy- 3，3-dime也yl-biphenyD 。这进一步 验证了菌株 X7B 4SM 脱硫途径。 i哀结果表明，菌株 X7B 的脱硫酶系不同于 以前报道的菌株。同时，使用 Gibbs 试剂法，检测到菌株降解苯并唾盼 C Benzothiphene ，BTH) 生成了带有经基的物质，说明菌株 X7B 也可以降解 Bπf ， 由上述结果可以知道，菌株在脱硫过程中，对于 DBT 衍生物，其脱硫的速 率，脱硫的专一性，受到取代基团类型及其位置的影响。 使用脉冲场电泳，质粒提取， Sour由em 杂交技术，验证菌株脱硫性状是由 一个大质粒控制的。根据己经发表的脱硫基因序列的保守性，设计了寻|物，使用 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction ，PCR) 扩增了古地分枝杆菌 X7B 的脱硫基因，连接到 pUCm-T