超声波破碎.PPT

* （一）蛋白质复性方法 1、稀释与透析复性法 （1）稀释复性：将变性蛋白质溶液直接加入到复性缓冲液中，蛋白质周围变性剂浓度降低，从而使蛋白质折叠成天然构象。 优点：操作简单、快速。是目前最常用的蛋白质复性方法之一。 缺点：变性蛋白质会发生错误折叠或重新形成聚集体，造成复性率下降。 改进：将变性蛋白质加入到复性液中。 现状：需大容器、大量缓冲液和浓缩，成本较高，不适用于大规模。 * （2）透析复性：将变性蛋白质装入透析袋中，对复性缓冲液进行透析。也是基于去除变性剂的机理使蛋白质复性。 特点：透析过程主要是扩散作用，需时间较长，易造成蛋白质聚集。 改进：缓慢透析法，使变性剂浓度下降连续，不会出现变性剂浓度突变，可减少蛋白质复性中产生沉淀，提高活性蛋白效率。 *  2、色谱复性技术 （1）凝胶过滤色谱 也称体积排阻色谱，可实现变性剂去除与蛋白质复性同时进行。 采用适宜大小的凝胶过滤体系，根据折叠中间体的半径，通过捕获其不同形式将蛋白分子相互分开，减少中间体的相互作用，提高复性率。梯度缓冲液可有效增加活性蛋白质得率。 * （2）吸附色谱 利用色谱固相介质对变性蛋白的吸附作用，将其固定在介质表面，使蛋白质分子彼此分开。 疏水作用基质有提高复性率的效果。疏水作用基质与变性蛋白大量暴露疏水基团之间有疏水作用，能进一步降低聚集。 * 3、反胶束萃取复性法 将变性蛋白萃取到反胶束中，达到蛋白质分子彼此分开，从而提高蛋白质的复性率。 变性剂存在会抑制变性蛋白萃取过程。 * （二）提高复性率的策略 1、二硫键的形成 拥用多重二硫键的蛋白，需要更复杂的再折叠过程，要求氧化剂和还原剂在最佳浓度下，以便于二硫键的形成。 利用氧化型谷胱甘肽形成二硫键，有助于含二硫键蛋白的复性。 * 2、小分子添加剂 小分子添加剂可降低蛋白的聚集，可提高复性得率。 3、模拟体内蛋白折叠过程 细胞内，内源肽链的折叠和聚集受分子伴侣和折叠酶的调节。因此，共表达分子伴侣和折叠酶可提高外源蛋白的可溶性表达，提高复性率。但增加了后续纯化步骤，提高成本。 * 辅助折叠方式 利用复性液中的去污剂捕获变性蛋白，形成复合物，抑制蛋白聚集，然后加入环糊精从复合体中除去去污剂，使蛋白逐渐复性。 * 4、温和溶解工艺相结合提高复性率 调节pH值远离蛋白质的等电点，就可使蛋白在低浓度变性剂中溶解，使中间体不变成有聚集倾向的结构。氨基酸序列再折叠及纯化过程将变得简单。 * The CELL WALL is the total structure that defines the exterior of the cytoplasm. It includes the cytoplasmic membrane and one or two other layers in most prokaryotes. * 肽聚糖：含量高，占壁重的30~70% ；不同菌种中肽聚糖(肽链)组分不同,具重要分类意义 ◆??革兰氏阳性细菌肽聚糖（peptidoglycan）的结构 （幻灯片015.016.017.018）以Staphylococcus aureus为代表。肽聚糖层厚度为20~80nm，由约40层网状分子组成。网状的肽聚糖大分子是由大量小分子单体聚合而成的。每一肽聚糖单体含有三个组成部分：a)??? 双糖单位，N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸分子通过B-1，4-糖苷键连接而成；b)??? 短肽尾，由四个氨基酸连起来的短肽连接在N-乙酰胞壁酸分子上。这四个氨基酸是L-丙氨酸-D-谷氨酸-L-赖氨酸-D-丙氨酸；c)??? 肽桥，S. Aureus的肽桥为甘氨酸五肽。肽桥的氨基端与前一肽聚糖链中一个肽尾的第四氨基酸——D-丙氨酸的羧基相连接，而它的羧基端则与相邻的肽聚糖链中一个肽尾的第三氨基酸——碱性氨基酸L-赖氨酸的氨基相连接，从而使前后两个肽聚糖链交联起来。溶菌酶：A. Fleming，1922年发现，存在于卵清、人的泪液和鼻涕、部分细菌和噬菌体内，能有效地水解细菌肽聚糖，作用于肽聚糖骨架上的N-乙酰胞壁酸的C1与N-乙酰葡糖胺C4之间的B-1，4-糖苷键。 Gram positive cells have only two layers, the cytoplasmic membrane and a THICK LAYER of peptidoglycan as the outermost component. * 幻灯片023）以E. Coli为代表，肽聚糖含量 不足细胞壁的10%，一般由1~2层网状分子构成，在细胞壁上的厚度仅为~3nm。结构单体与革兰氏阳