链霉菌M1033同源重组葡萄糖异构酶缺陷型菌株的构建.PDF

第 44 卷 　第 20 期 科 　学 　通 　报 1999 年 10 月 简报 链霉菌 M1033 同源重组葡萄糖异构酶缺陷型 菌株的构建 ① ① ① ① ① ① 徐 冲 　廖 军 　谢 文 　程 阳 　朱国萍 　杨永辉 ① ① ② ① 陈承露 　陶丽梅 　牛立文 　王玉珍 ( 中国科学技术大学①生命科学学院; ②结构生物学开放实验室 ,合肥 230026) 摘要 　为实现有工业生产价值的葡萄糖异构酶双突变体酶 GI ( G138PG247D) 的稳定高效表 达 ,在建立 7 号淀粉酶链霉菌M1033 原生质体转化条件的基础上 ,构建了含 600 bp 不完整 GI ( G138PG247D) 结构基因片段的插入型同源重组质粒pXW ,并通过同源重组模式整合到M1033 ( ) 的染色体上 ,实现了 GI 基因的破坏 gene disruption ,获得了同源重组葡萄糖异构酶缺陷型菌 株. 对同源重组片段的分析 ,突变引入的验证以及缺陷型菌株稳定性的检测证实了以此方法 在染色体上引入突变的可行性. 关键词 　葡萄糖异构酶 　链霉菌 　同源重组 　基因破坏 ( ) 葡萄糖异构酶 glucose isomerase , GI ,又称木糖异构酶 ,是工业生产上大规模以淀粉制备 高果糖浆的关键酶 , 同时也是一个较好的蛋白质工程研究模型. 我们在分离得到 7 号淀粉酶 链霉菌 M1033 的葡萄糖异构酶基因后[1 ] ,利用 pT7 系统实现了其在大肠杆菌中的高表达[2 ] . 同时依据0. 19 nm 分辨率野生型晶体结构模型[3 ] 和分子模拟设计 ,分别构建成功单突变体酶 GI( G138P) [4 ]和 GI( G247D) . 进一步通过 DNA 重组构建成功双突变体酶 GI ( G138PG247D) . 初步分析认为 , 由于 GI 第 138 位的 Gly 被突变后的 Pro 取代 ,引入的吡咯烷环侧链恰好填充了 由于 Gly 无侧链基团而留下的空洞 ,使 GI 空间结构更具刚性 ,从而导致 GI( G138P) 的最适反应 ( ) 温度提高约 10 ℃,热稳定性提高约 1 倍 专利公开号 :CN1156182A ;而 GI 基因第 247 位的点突 变引入 Asp 后可能由于 Asp 具有较强的电负性 ,从而改变了 GI 活性部位的电荷传递过程 ,导 致 GI( G247D) 的酶活提高约50 %. 双突变体酶 GI ( G138PG247D) 的酶活为 GI ( G138P) 的 158 倍 ,热失活半衰期在以葡萄糖为底物时提高到 124 倍 ,在以木糖为底物时提高到 4. 06 倍 ,较 两种单突变体酶中任一种具有更高的酶活及热稳定性. 考虑到链霉菌质粒表达系统中的结构 不稳定性和序列丢失现象 ,拟通过同源重组的方法将突变位点置换回 M1033 染色体 ,从而实 现双突变体酶的稳定高效表达. 本文报道了 7 号淀粉酶链霉菌M1033 遗传背景分析及原生质 体制备、转化条件的建立以及链霉菌 M1033 同源重组 GI 缺陷型菌株的构建. 1 　材料与方法 ( ) 　　 ⅰ 菌株与质粒. 　大肠杆菌 NM522 、7 号淀粉酶链霉菌M1033 、单链丝状噬菌体M13K07 ( ) 均为本实验室贮藏. 含有 GI G138PG247D 基因全序列的重组质粒pUB ⅠGI Ⅱ