基于化学蛋白质组学方法研究赖氨酸乙酰化修饰相关蛋白的鉴定-分析化学专业论文.docx

万方数据 万方数据 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：鲁聪聪 2015 年 6 月 1 日 非公开学位论文标注说明 (本页表中填写内容须打印) 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 申请密级 □限制(≤2 年) □秘密(≤10 年) □机密(≤20 年) 保密期限 20 年 月 日至 20 年 月 日 审批表编号 批准日期 20 年 月 日 南开大学学位评定委员会办公室盖章(有效) 注：限制★2 年(可少于 2 年);秘密★10 年(可少于 10 年);机密★20 年(可少于 20 年) 中文摘要 中文摘要 中文摘要 在复杂生命体系中，对痕量蛋白质实现高灵敏、高精度的检测是当前生物 分析技术面临的挑战。生物质谱（MS）具有高分辨率、高精确度、高灵敏度和 高通量的优点，且能够与亲和富集和色谱分离等技术联用，是目前对蛋白质进 行大规模鉴定和深度解析的有效方法。 蛋白质赖氨酸乙酰化（Lysine Acetylation）是一种分布广泛的翻译后修饰， 几乎参与所有的生物活动，在基因转录和能量代谢等过程具有重要的调控功能， 近年来在国际上备受关注。越来越多的证据表明：赖氨酸乙酰化及其相关蛋白 （例如：乙酰化转移酶（HAT），去乙酰化酶（HDAC）、底物蛋白及其结合蛋 白）的表达异常，与肿瘤等疾病的发生、发展密切联系。以 HDAC 为靶标的小 分子抑制剂，已成为新一代的靶向抗癌药物。乙酰化相关蛋白的分析鉴定，有 利于进一步揭示其参与的疾病分子机制、发展新的疾病标志物。然而，由于大 部分乙酰化丰度较低、在酶的作用下动态且可逆变化、底物蛋白形式复杂等原 因，使得其相关蛋白的分离分析仍面临巨大的困难。因此，发展高灵敏的赖氨 酸乙酰化修饰相关蛋白的分析新方法具有重要的研究意义和应用价值。 本工作以赖氨酸乙酰化相关蛋白为目标，分别以抗体、小分子、多肽和适 配子作为探针，联合多种分离方法和质谱鉴定，发展了赖氨酸乙酰化相关蛋白 的分离分析新方法，具体研究内容如下： 第一部分：作为Ⅰ类 HDAC 家族的成员，HDAC8 由于缺少保守的 C 端结 构域而具有特殊的性能。目前，已发现的 HDAC8 的调控蛋白还很少，其调控机 制尚不清楚。联合抗体富集、多维分离和定量蛋白质组学方法，我们研究了在 HDAC8 选择性抑制剂——PCI-34051 刺激下，Hela 细胞全蛋白质组和乙酰化组 的变化规律。通过对 2000 多个蛋白的定量比较，我们发现 113 个蛋白的丰度在 药物作用下发生了明显改变。其中，上调蛋白 44 个，下调蛋白 69 个。生物信 息学分析表明，这些差异蛋白与细胞分化、代谢及凋亡等重要生命过程具有关 联。乙酰化修饰的定量分析进一步表明，有 8 个乙酰化位点发生明显上调，而 其底物蛋白的丰度变化不大。这一结果揭示：这些乙酰化的上调并非由蛋白过 表达造成，可能是在 PCI-34051 刺激下、其调控酶活性发生改变而引起的，可能 I 是潜在的 HDAC8 调控的底物蛋白。 第二部分：伏立诺他（SAHA）是一种非常重要的广谱型 HDAC 抑制剂， 其相互作用蛋白的揭示，对于理解药物的具体调控机理、扩展其在临床的应用 具有重要意义。在保留 SAHA 活性结构的基础上，我们设计并构建了 SAHA 小 分子探针。通过探针的亲和富集，联合 HPLC-MS/MS 分析，发现了 58 个可能 与 SAHA 发生作用的蛋白及复合物。生物信息学分析表明，这些蛋白主要参与 能量代谢和蛋白合成过程。除去已报道的底物蛋白及蛋白复合物，α-烯醇化酶 （ENO1）作为新的 SAHA 底物蛋白复合物被发现并验证。 第三部分：组蛋白赖氨酸修饰是表观遗传学的重要内容，通过修饰位点招 募结合蛋白，是实现其对基因转录调控的一种重要方式。我们以含有赖氨酸修 饰的多肽为识别探针，结合 DNA 模板控制技术，设计了一种基于 DNA 杂交的 双探针体系，发展了一种研究赖氨酸修饰结合蛋白的新方法。实验结果表明： 这一方法可以选择性识别并富集与赖氨酸修饰相结合的植物同源结构域（PHD 结构域）。光交联反应的引入，可以将结合蛋白进行共价键合，从而改善了由 于蛋白质-蛋白质相互作用较弱而难以富集的问题，同时也为探究蛋白赖氨酸修 饰与结合蛋白的空间作用关系提供了