胶体金免疫层析试纸条定量检测猪尿以及猪肉中的克伦特罗残留-食品科学专业论文.docxVIP

摘要 摘要 万方数据 万方数据 摘 要 免疫层析试纸条定量是一种利用光学传感器实现待测物快速定量检测的分 析方法，具有试纸条检测的简单快速、抗干扰性强及可现场筛查等优点。近年来， 免疫层析试纸条定量检测的文献报道逐年增多，但通过试纸条免疫动力学反应探 讨影响免疫层析试纸条定量因素的相关文献报道较少。本研究以克伦特罗为研究 对象，探讨了胶体金免疫层析试纸条T/C比值法定量检测猪尿及猪肉中克伦特罗 残留的主要影响因素及其可行性。课题研究旨在为建立胶体金免疫层析试纸条定 量分析方法提供基础数据及理论依据。 本研究通过三因素三水平正交优化试验，确定了检测克伦特罗胶体金免疫层 析试纸条的最佳生产工艺条件：抗体标记量为1 μg/mL胶体金，10倍浓缩的金标 抗 体 喷 涂 量 为 3 μL/cm 结 合 垫 ， NC 膜 T 线 克 伦 特 罗 人 工 抗 原 喷涂 浓度为 0.5 mg/mL。在此基础上，建立了试纸条上金标抗体与NC膜T线抗原及NC膜C线二抗 免疫动力学反应的分析方法，探讨了样品的盐离子浓度、pH值、环境温度及试 纸条判读时间对试纸条定量分析的影响。免疫动力学分析结果表明，T/C比值法 可有效缩短定量分析的检测时间（T/C比值进入稳定期仅需10 min）；T/C比值法 在一定范围内可消除环境温度对定量分析结果的影响（10~37 ℃）；样品基质中 （尿样）盐离子浓度（0~0.5 mol/L）对试纸条的T/C比值影响较小；尿样的pH在 6~9之间，试纸条T/C比值比较稳定，pH≤5时试纸条T/C比值下降显著。以混合阴 性尿样为基质，拟合了试纸条定量检测标准曲线，即当尿液中克伦特罗浓度在 0.1~2.0 ng/mL范围内，胶体金试纸条标准曲线具有较好的线性，50%抑制浓度 (IC50)达到0.36 ng/mL（n=5）。该试纸条检测实际尿样中克伦特罗的最低检测限为 0.22 ng/mL。试纸条的批内和批间检测的变异系数均小于10%。采用试纸条和商 业化ELISA试剂盒同时分析50份阴性加标样品，结果显示两种方法具有较好的线 性相关性（R2=0.96）。进一步对90个不同来源的加标猪尿样品进行分析，96%的 样品回收率在70%~130%之间。以上结果表明，本研究建立的免疫层析试纸定量 方法可用于猪尿中克伦特罗的定量分析，且大大提高了试纸条的检测灵敏度，拓 宽了试纸条现场检测的适用范围。 同时，建立了胶体金试纸条定量检测猪肉中克伦特罗的方法。比较了5种猪 肉样本中简便提取克伦特罗的回收率差异，结果显示采用0.02 mol/L，含2.8% NaCl的HCl溶液抽提猪肉样品2次，克伦特罗提取得率76.7%，变异系数为7.4%。 其结果基本满足基层实验室快速筛查检测的需求。试纸条定量检测猪肉中克伦特 罗的线性范围为0.1~1.5 ng/g，最低灵敏度为0.19 ng/g。实际猪肉样本加标（0.5 II ng/g、1.0 ng/g、2.0 ng/g及3.0 ng/g）回收实验显示，回收率分别为60.4±12.8%， 70.24±4.2%，75.9±4.9%，71.1±5.0%。与传统ELISA方法比对，显示两种方法具 有较好的相关性（R2=0.91）。 本试验进一步采用生物素-链霉亲和素体系制备了克伦特罗免疫磁珠，建立 了猪肉中克伦特罗亲和纯化的前处理方法。通过条件优化，免疫磁珠最佳制备工 艺如下：将1 mg链霉亲和素（SA）磁珠（含23.9 μg SA）与220 μg生物素化抗体 反应，最终每毫克磁珠表面抗体偶联量为77.2 μg。采用免疫磁珠净化猪肉中克伦 特罗的最佳条件如下：将4 mL HCl溶液（0.15 mol/L）与1 g猪肉匀浆样品混合， 在剧烈震荡条件下提取5~10 min；16000 rpm离心5 min；上清液中加入0.25 mg免 疫磁珠吸附，磁力架分离磁珠；100 μL甲醇洗脱磁珠上克伦特罗。结果表明，每 克猪肉中克伦特罗加标量为0.25、0.5、1.0、2.0及5.0 ng时，免疫磁珠吸附效率介 于61.2%~109.1%之间，相对标准偏差为7.8%~15.7%。 关键词：免疫层析试纸条；克伦特罗；定量检测；免疫磁珠 III Abst Abstract ABSTRACT Immunochromatographic strip (ICS) assay using optical sensor can realize a rapid quantitative detection with the advantages of simplicity, rapidity, on-site monitoring. In recent years, a number of papers have been reported t